Tecniche della Biologia Molecolare

Presentazione sul tema: "Tecniche della Biologia Molecolare"— Transcript della presentazione:

1 Tecniche della Biologia Molecolare
Amaldi Cap 21 (vari paragrafi) Allison Cap 8 e 9 (vari paragrafi)

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5 Uso di sonde di DNA per l’identificazione e l’analisi di sequenze nucleotidiche
Ibridazione A saturazione Ibridazione in situ o citologica Southern e Northern Blot Ibridazione su colonia o su placca Microarray (o microchip)

6 Ibridazione in situ o citologica

7 Microarray

8 Microarray

9 Tecnologie di base per l’isolamento e la manipolazione dei geni
Ingegneria genetica o Tecnologia del DNA ricombinante Enzimi di restrizione e DNA Ligasi Vettori di clonaggio Plasmidi Trasformazione di cellule di E. coli e selezione dei trasformanti Plasmidi della serie pUC: selezione blu bianco Vettori di espressione e produzione di proteine ricombinanti Batteriofago Lamda Cosmidi Vettori per il clonaggio e l’espressione in cellule eucariotiche Vettori di lievito Vettori per il trasferimento genetico in cellule animali Trasferimento di DNA all’interno di Vegetali

10 Clonaggio

11 Enzimi di restrizione e DNA Ligasi

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13 Vettori di Clonaggio Plasmidi Cosmidi Fagi Cromosomi artificiali:
Lievito (YAC) Batterici (BAC) Plasmidici (PAC) Vettori di espressione in Procarioti, Eucarioti, Piante Virus

14 Vettori di Clonaggio

15 Plasmidi della serie pUC: selezione blu bianco

16 Vettori di Espressione: E.Coli

17 Batteriofago Lamda

18 Cosmide

19 Vettori di Lievito: vettori plasmidici

20 Vettori di Lievito: YAC

21 Banche di DNA – DNA library
Banche genomiche Rappresentatività di una libreria di DNA genomico Libreria di cDNA Identificazione del clone contenente il DNA di interesse da una libreria

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30 PCR – Reazione a catena della polimerasi
Polymerase Chain Reaction (Mullis, 1983) Taq Polymerase Ciclo di PCR: Denaturazione del DNA Associazione (Annealing) degli inneschi (primer) Sintesi da parte della polimerasi

31 Ciclo di PCR: Denaturazione del DNA: 30 sec a 95°
Associazione (Annealing) degli inneschi (Primer) 30 sec a 40-60°C per favorire l’associazione specifica degli inneschi (La temperatura deve essere di circa 5°C al di sotto della Tm degli inneschi) Sintesi da parte della polimerasi: 2 min a 72°C che è la temperatura ottimale per la Taq polimerasi

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33 RT-PCR & Real Time PCR RT-PCR = PCR su un campione di DNA retrotrascritto a partire da RNA mediante Reverse Transcriptase Real Time PCR = PCR in tempo reale, per l’analisi degli amplificati (quantità) durante l’amplificazione,

34 Real Time PCR

35 Determinazione della sequenza nucleotidica del DNA
Metodo chimico (Maxam & Gilbert) Metodo enzimatico (Sanger)

36 Principio del seq

37 Metodo chimico - Maxam & Gilbert

38 Metodo enzimatico - Sanger

39 piattaforme di sequenziamento di nuova generazione - NGS
In Uso Tecnologia 454 – 454 Genome Sequencer FLX di Roche Piattaforma Illumina – Genome Analyzer Sistema SOLiD – Applied Biosystem Altre Helicos Biosciences ION Torrent

40 Tecnologia 454 – 454 Genome Sequencer FLX di Roche

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42 Piattaforma Illumina – Genome Analyzer

43 Sistema SOLiD – Applied Biosystem

44 Campi applicazioni NGS
Sequenziamento de novo e risequenziamento di genomi complessi Identificazione di siti polimorfici e mutazioni Analisi del trascrittoma Studio dell’Interazione DNA- Proteine Caratterizzazione del metiloma e studio dell’editing Metagenomica

45 21.9 Valutazione dell’espressione di un gene

46 21.10 Inibizione dell’espressione di geni specifici
RNA antisenso Intereferenza da RNA

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