Condizioni che possono destabilizzare la doppia elica provocando la separazione delle due catene (denaturazione) 1.Alte temperature 2.pH alcalino estremo.

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1 Condizioni che possono destabilizzare la doppia elica provocando la separazione delle due catene (denaturazione) 1.Alte temperature 2.pH alcalino estremo (>13) 3.Bassa forza ionica [Na + ] 4.Presenza in soluzione di sostanze che rompono i ponti a idrogeno (urea, formamide). Ibridazione degli acidi nucleici

2 La denaturazione della doppia elica si accompagna a grosse variazioni delle proprietà fisiche delle soluzioni di DNA 1.Diminuzione della viscosità 2.Aumento di assorbanza a 260nm 3.Variazione dell’attività ottica

3 Curve di denaturazione

4 La denaturazione non è un processo irreversibile. Infatti se dopo la separazione delle eliche si fa scendere gradualmente la temperatura, le singole eliche complementari si possono riappaiarea doppia elica può riformarsi. Questo processo si chiama ibridazione.

5 La discesa graduale della temperatura e la permanenza delle molecole per un certo tempo pochi gradi al di sotto della temperatura di denaturazione sono fondamentali affinchè ci possa essere ibridazione, processo dipendente dai moti di agitazione termica. Se dopo la denaturazione la soluzione viene portata a bassa temperatura non si ha ibridazione, ma stabilizzazione della struttura secondaria delle singole catene.

6 Per mezzo dell’ibridazione si possono formare delle doppie eliche di DNA- DNA, DNA-RNA o RNA-RNA. La condizione fondamentale perché ciò avvenga è che in soluzione si mettano molecole con sequenza complementare (antiparallele). L’ibridazione è una forma di riconoscimento molecolare estremamente specifica.

7 In condizioni opportune di temperatura e forza ionica (stringenza) si possono ottenere anche delle eliche in cui sono tollerati degli appaiamenti non perfetti

8 Effetti della stringenza di ibridazione

9 Cinetiche di rinaturazione

10 Come calcolare la temperatura di ‘melting’ (denaturazione) di una molecola di DNA Tm= 81.5 o C – 16.6(log 10 [Na + ]) + +0.41(%G+C) – 0.63 (%Formamide) – –(600 / lunghezza) Valida per concentrazioni di sodio comprese tra 0.01M e 0.4M Valida per %G+C tra 30% e 75% Diminuisce di 1-1.5 gradi per ogni 1% di differenza nelle sequenze

11 Come calcolare la temperatura di ‘melting’ (denaturazione) di oligonucleotidi Formula più semplice (non molto precisa, ma abbastanza valida per oligonucleotidi < 20 basi): 4 o C per ogni G o C 2 o C per ogni A o T

12 Come calcolare la temperatura di ‘melting’ (denaturazione) di oligonucleotidi Formula più complessa (risultati ragionevoli tra 14 e 70 basi): Tm= 81.5 o C – 16.6(log 10 [Na + ]) + +0.41(%G+C) –(600 / lunghezza)

13 Come calcolare la temperatura di ‘melting’ (denaturazione) di oligonucleotidi Metodo più rigoroso: nearest neighbor Interazione  H  S  G AA/TT9.124.01.9 AT/TA8.623.91.5 TA/AT6.016.90.9 CA/GT5.812.91.9 GT/CA6.517.31.3 CT/GA7.820.81.6 GA/CT5.613.51.6 CG/GC11.927.83.6 GC/CG11.126.73.1 GG/CC11.026.63.1

14 Metodo più rigoroso: nearest neighbor Calcolo entalpia di transizione per oligonucleotidi  H totale =  h i +  h x 11.0 9.1 9.1 11.0  G-G-A-A-T-T-C-C * * * * * * * * C-C-T-T-A-A-G-G  5.6 8.6 5.6  h x = 60 kcal  H osservato=58.3 kcal

15 Programma per calcolare le temperature di melting degli oligonucleotidi con i diversi metodi: http://www.basic.nwu.edu/biotools/oligocalc.html

16 Sintesi chimica oligonucleotidi: Con questo sistema si possono sintetizzare in vitro singoli filamenti di DNA di grandezza compresa tra 6 e 100 nucleotidi

17 Le DNA polimerasi batteriche possono essere purificate e utilizzate per sintetizzare DNA in vitro DNA stampo (singolo filamento) 5’3’ Primer sintetico 3’ 5’ DNA polimerasi dATP dCTP dGTP dTTP

18 Le DNA polimerasi batteriche possono essere purificate e utilizzate per sintetizzare DNA in vitro DNA stampo (singolo filamento) 5’3’ 5’ DNA polimerasi

19 Le DNA polimerasi batteriche possono essere purificate e utilizzate per sintetizzare DNA in vitro 5’3’ 5’ 3’

20 Traccianti utilizzati Nucleotidi marcati con isotopi radioattivi

21 Traccianti utilizzati Nucleotidi marcati con sostanze non radioattive

22 Traccianti utilizzati Nucleotidi marcati con sostanze non radioattive - Fluorocromi (marcatura diretta) - Enzimi (perossidasi, fosfatasi alcalina) - Digossigenina (riconosciuta da anticorpi specifici marcati con fluorocromi o enzimi) - Biotina (riconosciuta da avidina marcata con fluorocromi o enzimi)

23 Traccianti utilizzati Fluorocromi

24 POLIMERASE CHAIN REACTION (PCR) -E’ UNA PROCEDURA PER OTTENERE IN GRANDE QUANTITA’ UNA SPECIFICA SEQUENZA DI DNA IN VITRO -QUESTA TECNICA PUO’ AMPLIFICARE UN TRATTO DI DNA PER PIU’ DI UN MILIONE DI VOLTE

25 ELEMENTI NECESSARI ALLA REAZIONE: 1- DUE OLIGONUCLEOTIDI COMPLEMENTARI A DUE REGIONI CHE SI TROVANO SU FILAMENTI OPPOSTI DEL DNA STAMPO AI LATI DELLA REGIONE CHE SI VUOLE AMPLIFICARE 2- DNA STAMPO CHE CONTENGA LA REGIONE DA AMPLIFICARE 3- POLIMERASI TERMOSTABILE (NON VIENE DENATURATA SE PORTATA A 95° C) 4- I 4 DESOSSINUCLEOTIDI TRIFOSFATI

26 PROCESSO DI PCR PREVEDE UN CERTO NUMERO DI CICLI. OGNI CICLO CONSISTE DI 3 PASSAGGI: 1- DENATURAZIONE: TEMP. 95°C. IL DNA STAMPO VIENE DENATURATO 2-APPAIAMENTO: 55°C CIRCA. I PRIMERS SI APPAIANO CON IL DNA STAMPO 3- SINTESI: TEMP.72°C E’ OTTIMALE PER IL FUNZIONAMENTO DI Taq (Termus aquaticus) POLIMERASI

27

28 PCR

29 Cosa sono gli enzimi di restrizione Sono enzimi che tagliano la doppia elica del DNA in corrispondenza di specifiche sequenze. Per questo motivo vengono anche detti endonucleasi di restrizione (invece le esonucleasi distruggono il DNA partendo dalle estremità). Ne esistono molti tipi diversi, ognuno dei quali riconosce una sequenza particolare.

30 Gli enzimi di restrizione proteggono i batteri dall’introduzione di molecole di DNA esogeno Batterio ceppo A Batteriofagi Batterio ceppo B Batterio lisato Batterio vivo

31 -Nel 1970 Hamilton Smith ha isolato il primo enzima che taglia il DNA a livello di una sequenza nucleotidica specifica. -Endonucleasi di restrizione e metiltransferasi formano il SISTEMA DI MODIFICAZIONE E RESTRIZIONE dei batteri.

32 SISTEMI DI RESTRIZIONE E MODIFICAZIONE TIPO I: -primo ad essere scoperto -composta da 3 subunità:1-riconosce la seq di dna 2-metila il DNA 3-taglia il DNA -devono essere presenti in complesso per funzionare - NON TUTTI I SITI RICONOSCIUTI VERRANNO TAGLIATI ALCUNI SARANNO METILATI. -SEQ RICONOSCIUTE SONO LUNGHE E NON PALINDROMICHE -IL TAGLIO AVVIENE LONTANO DALLE SEQ RICONOSCIUTE

33 TIPO III: Simile al tipo I. Costituito da 3 subunità. -NON TUTTI I SITI VENGONO TAGLIATI -RICONOSCE SEQ. PALINDROMICHE -TAGLI A CIRCA 5 pb DI BASI DI DISTANZA TIPO II: Costituite da due subunità 1-metila il DNA 2-taglia - FUNZIONANO ANCHE SEPARATE! - RICONOSCONO SEQ PALINDROMICHE - TAGLIANO ALL’INTERNO DI SEQ RICONOSCIUTE O A DISTANZA DEFINITA. - UTILIZZATE PER MAPPARE E CLONARE IL DNA.

34 ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE DI TIPO II -Servono a tagliare il DNA in modo preciso e prevedibile -Sono stati isolati più di 1200 enzimi da procarioti -Riconoscono più di 130 diverse sequenze nucleotidiche (sequenze palindromiche di 4,6 o 8 nucleotidi). Eco RI 5’ GAATTC 3’ 3’ CTTAAG 5’ Not I 5’ GCGGCCGC 3’ 3’ CGCCGGCG 5’ Hae III 5’ GGCC 3’ 3’ CCGG 5’

35 Il taglio con gli enzimi di restrizione può generare diversi tipi di estremità. Eco RV= blunt -GATATC- -GAT 3’ 5’ ATC- -CTATAG- -CTA 5’ 3’ TAG- Pst I= 3’ protruding -CTGCAG- -CTGCA 3’ 5’ G- -GACGTC- -G 5’ 3’ ACGTC- Eco RI= 5’ protruding -GAATTC- -G 3’ 5’ AATTC- -CTTAAG- -CTTAA 5’ 3’ G-

36 QUANTE VOLTE TAGLIA UN ENZIMA DI RESTRIZIONE? La maggior parte riconosce palindromi di 4 o 6 nucleotidi se assumiamo che i 4 nucleotidi siano distribuiti a caso nelle molecole di DNA: -per enzimi che riconoscono palindromi di 4 nt si avrà IN MEDIA un taglio ogni 256 nucleotidi (4x4x4x4). -per enzimi che riconoscono palindromi di 6 nucleotidi avremo IN MEDIA un taglio ogni 4.096 nucleotidi (4 6 ).

37 Il DNA digerito con gli enzimi di restrizione può essere analizzato mediante elettroforesi Plasmide (P) DNA genomico (G) 3 x 10 9 basi Eco RI (E) Eco RI M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Bam HI (B) PP+BP+EG+E 10 kb + -

38 MAPPATURA ENZIMATICA DI UN TRATTO DI DNA 6.6 bp PstI HindIII 1.1 kb 0.6 kb 2.3 kb 1.2 kb 1.4 kb PstIHindIII M 1 2 3 4 + 0,5 PstI+HindIII 1.1 1.4 4.1 - 1.7 2.3 2.6 1.1 0.6 2.3 1.4 1.2

39 Gli enzimi di restrizione, consentendo di tagliare il DNA in frammenti non casuali, la cui grandezza dipende unicamente dalla sequenza, costituiscono un formidabile strumento sia per l’analisi che per la manipolazione del DNA.

40 Le DNA ligasi sono enzimi capaci di legare covalentemente due molecole di DNA adiacenti con estremità libere