Definizione di genoteca (o library) di DNA

Presentazione sul tema: "Definizione di genoteca (o library) di DNA"— Transcript della presentazione:

1 Definizione di genoteca (o library) di DNA
Collezione completa di frammenti di DNA, inseriti singolarmente in un vettore di clonaggio. Possono essere di DNA genomico o di cDNA.

2 Le genoteche o librerie di DNA:
Libreria genomica: collezione di cloni che include tutto il DNA genomico di una certa specie (es. il genoma umano aploide contiene circa 3x109 coppie di basi, che possono essere contenute in circa 1.5x105 cloni di 20 kb ciascuno) Libreria di cDNA: collezione di cloni che include tutte le specie di mRNA (trascritte in cDNA) espresse in un dato tessuto, incluso quelle piu’ rare

3 Costruzione di librerie genomiche

4 Costruzione di librerie di cDNA

5 Materiale di partenza: cDNA libraries
Oligo-dT priming RT 3’ First DNA strand TTTTTTTT 5’ AAAAAAAA 3’ 5’ mRNA Random priming First DNA strand RT 5’ AAAAAAAA 3’ 5’ mRNA

6 Materiale di partenza: cDNA libraries Sintesi del secondo filamento
AAAAAAAA 3’ 5’ TTTTTTTT 5’ 3’ First DNA strand mRNA RNAsi H + DNA polimerasi I 5’ TTTTTTTT 5’ 3’ AAAAAAAA 3’ pH alcalino AAAAAAAA 3’ TTTTTTTT 5’ 3’ 5’ DNA polimerasi + ligasi Second DNA strand AAAAAAAA 3’ 5’ TTTTTTTT 5’ 3’ First DNA strand

7 Materiale di partenza: cDNA libraries Sintesi del secondo filamento
AAAAAAAA 3’ 5’ TTTTTTTT 5’ 3’ First DNA strand mRNA RNAsi + DNA polimerasi AAAAAAAA 3’ TTTTTTTT 5’ Second DNA strand Loop Nucleasi S1 + DNA polimerasi Second DNA strand AAAAAAAA 3’ 3’ TTTTTTTT 5’ 5’ First DNA strand

8 cDNA-1 (full-lenght) mRNA cDNA-2 cDNA-3 cDNA-4
La sintesi del cDNA produce, a partire da molecole di messaggero uguali, molecole di DNA di diversa lunghezza. Sovrarappresentazione del 3’ se la sintesi è innescata da oligo-dT AAAAAAAA 3’ 5’ TTTTTTTT 5’ 3’ mRNA cDNA-1 (full-lenght) AAAAAAAA 3’ 5’ TTTTTTTT 5’ 3’ cDNA-2 AAAAAAAA 3’ 5’ TTTTTTTT 5’ 3’ cDNA-3 AAAAAAAA 3’ 5’ TTTTTTTT 5’ 3’ cDNA-4

9 Vettori plasmidici

10 Vettori fagici

11 Vettori fagici Left Right Ligasi Concatameri

12 Il cDNA può essere clonato direzionalmente
TTTTTTTTGAATTC 5’ EcoRI 3’ 5’ AAAAAAAA 3’ mRNA dCTP + transferasi terminale AAAAAAAA 3’ 5’ 3’CCCCCC TTTTTTTTGAATTC 5’ RNAsi o pH alcalino 3’CCCCCC TTTTTTTTGAATTC 5’ 5’AAGCTTGGGGGG 3’ Hind III DNA polimerasi 3’TTCGAACCCCCC TTTTTTTTGAATTC 5’ 5’AAGCTTGGGGGG AAAAAAAACTTAAG 5’ EcoRI Hind III

13 Ospiti Virus (Batteriofagi) Batteri Colonie Placche di lisi

14 Screening di una library, ossia come trovare un ago in un pagliaio

15 Screening di una library, ossia come trovare un ago in un pagliaio

16 Screening di una genoteca, ossia come trovare un ago in un pagliaio

17 Analisi dei cloni ottenuti
Crescita dei cloni, purificazione del DNA plasmidico o fagico e analisi con enzimi di restrizione Sequenziamento Sottoclonaggio

18 Walking cromosomico Identificare tutta la sequenza di un gene (o di un mRNA) a partire da un frammento parziale iniziale Sonda 3 Sonda 4 Sonda 1 Sonda 2 Gene A E C F D B G

19 Sequenziamento enzimatico del DNA (Sanger)
T G C A

20

21 5’ 3’ TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA 3’ 5’

22 TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT
5’ 3’ AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA 3’ 5’

23 TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT
5’ 3’ AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA 3’ 5’ TTACGTAACGTCA 5’ 3’

24 TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT
5’ 3’ AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA 3’ 5’ TTACGTAACGTCA

25 TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT
5’ 3’ AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA 3’ 5’ TTACGTAACGTCA dA dC dG dT + DNA Polimerasi

26 TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT
5’ 3’ AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA 3’ 5’ TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT

27 TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT
5’ 3’ AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA 3’ 5’ TTACGTAACGTCA dA dC dG dT + DNA Polimerasi ddA ddC ddG ddT

28 TTACGTAACGTCAG 14 AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA TTACGTAACGTCAGA 15 AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA TTACGTAACGTCAGAA 16 AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA TTACGTAACGTCAGAAC 17 AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA TTACGTAACGTCAGAACG 18 AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA TTACGTAACGTCAGAACGT 19 AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA TTACGTAACGTCAGAACGTC 20 AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA

29 - Elettroforesi Laser Fluorimetro +

30 A C G T - Elettroforesi Lettura G Laser Fluorimetro +

31 A C G T - Elettroforesi Lettura GAAC Laser Fluorimetro +

32 Elettroferogramma

33 Esempio di clonaggio di un gene

34 Clonaggio del gene a seguito di isolamento della proteina: Identificazione del gene dell’emofilia A (fattore VIII)

35 Gene: basi mRNA: 7000 basi Proteina: 2351 a.a.

36 Purificazione del fattore VIII di maiale con tecniche biochimiche tradizionali

37 Microsequenza AGGFLMKMFGGHTSREDFCH AHHTFIAAVEQLWDYGMATT
FGKRMLKFSSCHTRDEGGAK

38 Sequenze possibili Sequenza effettiva mRNA-maiale N C His Tyr Phe Ile
G GCU GCA A C G GCU GCG A C G GUU GUC A C C G UUU CUG A C G GGU C A C AUU AUC C CAU CAC C UAU C UUU UUC A GAG GAA A CAG C GAU C UAU UAC UGG AUG His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Gln Leu Trp Asp Tyr Gly Met 5’ mRNA-maiale 3’ Sequenza effettiva

39 Ibridazione di cDNA library di fegato di maiale con un oligonucleotide degenerato
His Tyr Phe Ile Ala Val Glu Gln Leu Trp Asp Gly Met C CAU UAU A GAG AUU G GCU GUU CAG UUU C G UGG GAU GGU AUG 5’ 3’ TGGGATTATGGTATG TGGGACTATGGTATG TGGGATTACGGTATG TGGGACTACGGTATG TGGGATTATGGGATG TGGGACTATGGGATG TGGGATTACGGGATG TGGGACTACGGGATG TGGGATTATGGCATG TGGGACTATGGCATG TGGGATTACGGCATG TGGGACTACGGCATG TGGGATTATGGAATG TGGGACTATGGAATG TGGGATTACGGAATG TGGGACTACGGAATG CACTATTTCATCGCAGCGGTCGAACAGCTGTGGGATTACGGTATG GTGATAAAGTAGCGTCGCCAGCTTGTCGACACCCTAATGCCATAC

40 Ibridazione di cDNA library di fegato di maiale con un oligonucleotide degenerato
TGGGATTATGGTATG TGGGACTATGGTATG TGGGATTATGGGATG TGGGACTATGGGATG TGGGATTATGGCATG TGGGACTATGGCATG TGGGATTATGGAATG TGGGACTATGGAATG TGGGATTACGGTATG TGGGACTACGGTATG TGGGATTACGGGATG TGGGACTACGGGATG TGGGATTACGGCATG TGGGACTACGGCATG TGGGATTACGGAATG TGGGACTACGGAATG CACTATTTCATCGCAGCGGTCGAACAGCTGTGGGATTACGGTATG GTGATAAAGTAGCGTCGCCAGCTTGTCGACACCCTAATGCCATAC

41 Ibridazione di cDNA library di fegato di maiale con un oligonucleotide degenerato
TGGGATTATGGTATG TGGGACTATGGTATG TGGGATTATGGGATG TGGGACTATGGGATG TGGGATTATGGCATG TGGGACTATGGCATG TGGGATTATGGAATG TGGGACTATGGAATG TGGGACTACGGTATG TGGGATTACGGGATG TGGGACTACGGGATG TGGGATTACGGCATG TGGGACTACGGCATG TGGGATTACGGAATG TGGGACTACGGAATG CACTATTTCATCGCAGCGGTCGAACAGCTGTGGGATTACGGTATG TGGGATTACGGTATG GTGATAAAGTAGCGTCGCCAGCTTGTCGACACCCTAATGCCATAC

42 Clone di cDNA di maiale gagtgcagccaacccgccctgatgaagatgaagcacgtgagcagctttgtccagaagtat E C S Q P A L M K M K H V S S F V Q K Y tccgacaccatagccgagttgcgggagctgcagccgtcggcgagagacttcgaagttcga S D T I A E L R E L Q P S A R D F E V R agccttgtgggctgtggtcacttcgctgaacactatttcatcgcagcggtcgaacagctg S L V G C G H F A E H Y F I A A V E Q L tgggattacggtatgaaaatcatgaagaagaaggctttgctggcccaggaacaggtttca W D Y G M K I M K K K A L L A Q E Q V S tttttcgaggaggagaggaacatattatctcggagcacgagtccttggatcccccagtta F F E E E R N I L S R S T S P W I P Q L

43 Per trovare il gene umano, library genomica o di cDNA?
Sonda Human: 269 atgacacctcaacccagtggtccaaaaacatgaaacatttgaccccgagcaccctcacac 328 ||||||| |||||||||||||||||||||||||| ||||| ||| | | |||||||||| Pig: atgacacttcaacccagtggtccaaaaacatgaactatttggcccagggaaccctcacac 4081 Human: 329 agatagactacaatgagaaggagaaaggggccattactcagtctcccttatcagattg 386 ||||||| || |||||||| || ||| |||||||||||||||| ||| |||||||||| Pig: 4082 agatagagtataatgagaaagaaaaaagggccattactcagtcccccctatcagattg 4139

44 Screening di una cDNA library umana con la sonda di maiale (ibridizzazione a bassa stringenza)
mRNA f a b c d e cDNA consensus umano

45 Screening di library genomiche umane con sonde di cDNA umano
mRNA f c Library genomica fago l Library genomica BAC