IDENTIFICAZIONE: l’approccio tradizionale

Presentazione sul tema: "IDENTIFICAZIONE: l’approccio tradizionale"— Transcript della presentazione:

1 IDENTIFICAZIONE: l’approccio tradizionale

2 Identificazione convenzionale
Test biochimici Test colturali

3 Test biochimici Accumulo di niacina Riduzione dei nitrati Catalasi
semiquantitativa Idrolisi del Tween 80 Ureasi Riduzione del tellurito Arilsolfatasi β-glucosidasi

4 Niacina Prodotto del metabolismo micobatterico accumulato nel terreno
requisiti della coltura l’estrazione la rivelazione 24 ore Distingue il M. tuberculosis dalle altre specie Irregolarmente positiva nel M. simiae Raramente positiva in altri micobatteri

5 Nitrati Svariate specie micobatteriche sono in grado di ridurre i nitrati a nitriti 4 ore

6 Catalasi a 68°C Praticamente tutti i micobatteri producono catalasi
In quasi tutte le specie, ad eccezione di quelle del M. tuberculosis complex la catalasi è termoresistente incubazione a 68°C per 20 min rivelazione con H2O2 20 min

7 Catalasi semiquantitativa
I diversi tipi di catalasi prodotti dalle varie specie micobatteriche differiscono anche quantitativamente Il test permette di differenziare i ceppi che, in seguito all’aggiunta di H2O2, producono una colonna di bollicine superiore, o inferiore, a 45 mm 14 giorni

8 Idrolisi del Tween 80 Alcuni micobatteri possiedono una esterasi, grazie ad essa sono in grado di idrolizzare il Tween 80 Utilizzando Tween legato a rosso neutro, l’idrolisi è evidenziata dal viraggio al rosso 10 giorni

9 Ureasi Alcuni micobatteri sono in grado di idrolizzare l’urea
L’avvenuta idrolisi è indicata dal viraggio di un idoneo indicatore 3 giorni

10 Riduzione del tellurito
La capacità di ridurre il tellurito di potassio a tellurio metallico si evidenzia dalla formazione di un precipitato nero 10 giorni

11 Arilsolfatasi I micobatteri provvisti di arilsolfatasi sono in grado di idrolizzare la fenolftaleina tripotassica a fenolftaleina La fenolftaleina, in ambiente alcalino, sviluppa un colore rosso 3 giorni

12 β-glucosidasi I micobatteri che possiedono la β‑glucosidasi sono in grado di idrolizzare i β‑glucosidi liberando glucosio Usando come substrato il p‑nitrofenil‑D‑glucoside si ha liberazione di p‑nitrofenolo che è giallo 3 ore

13 Test colturali Velocità di crescita Temperature di crescita Pigmento
Morfologia delle colonie Test di inibizione selettiva

14 Velocità di crescita I micobatteri a crescita rapida formano colonie visibili ad occhio nudo in meno di una settimana I micobatteri a crescita lenta possono richiedere anche 6 settimane Il tempo richiesto per la crescita nella coltura primaria non è indicativo Il tempo richiesto per la crescita in coltura liquida non è indicativo Il test deve essere eseguito utilizzando un inoculo diluito

15 Temperature di crescita
Il range di temperatura che permettono lo sviluppo delle varie specie batteriche è ampio Oltre all’incubazione a 37°C è necessario provare almeno altre due temperature, 25-30°C e 42‑45°C

16 I micobatteri si distinguono in:
Pigmento I micobatteri si distinguono in: non cromogeni scotocromogeni fotocromogeni

17 Morfologia delle colonie
Aspetto macroscopico Aspetto microscopico (100x)

18 Test di inibizione selettiva
L’aggiunta al terreno di particolari sostanze permette di distinguere le specie che ne tollerano la presenza, che crescono, da quelle che ne risultano inibite TCH NaCl Tiacetazone Idrossilamina (MacConkey) NAP

19 Identificazione Confronto dei risultati dei test con i dati presenti in letteratura (tabelle)

20 Identificazione

21 Impiego attuale Identificazione del M. tuberculosis
Niacina + nitrati Identificazione dei MOTT Ampio pannello di test Supporto ad altri approcci identificativi Test mirati Velocità di crescita Pigmento Temperature di crescita

22 Conclusioni Non esistono kit commerciali
I tempi sono estremamente lunghi Non tutti i test sono perfettamente riproducibili L’affidabilità delle identificazioni è buona solo per le specie più comuni Non permettono di riconoscere i micobatteri rari o “nuovi” Alcuni test possono essere utilizzati per dirimere ambiguità emergenti da altri sistemi di identificazione Permettono di differenziare le specie all’interno del M. tuberculosis complex