PCR (polymerase chain reaction)

Presentazione sul tema: "PCR (polymerase chain reaction)"— Transcript della presentazione:

1 PCR (polymerase chain reaction)

2 PCR Scelta dello stampo Scelta dei primer

3 PCR da DNA genomico

4 PCR da mRNA (RT-PCR)

5 Uso dei “linkers”

6 Vettori dA:dT 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’

7 PCR da DNA genomico EcoRI BamHI BamHI EcoRI

8

9 Elettroforesi di acidi nucleici
Gel di agarosio Gel di acrilammide

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11 PREPARAZIONE GEL DI AGAROSIO

12 GEL DI AGAROSIO

13 Elettroforesi su gel di agarosio

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15 CARICAMENTO GEL DI AGAROSIO

16 CARICAMENTO GEL DI AGAROSIO

17 CARICAMENTO GEL DI AGAROSIO

18 GEL DI AGAROSIO

19 Tamponi di elettroforesi

20 Soluzioni di caricamento

21 Soluzioni di caricamento
Aumentano la densità del campione Colorano il campione Rendono visibile la corsa elettroforetica

22 Migrazione del DNA su gel

23 Fattori che influenzano la migrazione
Peso molecolare Concentrazione di agarosio Conformazione DNA Voltaggio applicato Intercalanti Tampone di elettroforesi

24 Visualizzazione del DNA

25 GEL DI AGAROSIO

26 Marcatori di peso molecolare
 HindIII

27 DNA circolare con superavvolgimento = 0 DNA superavvolto negativamente

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29 Fotodocumentazione

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31 Recupero DNA da gel Elettroeluizione Agarosio “low melting”
Solubilizzazione agarosio

32 Gel di acrilammide

33 Apparato per gel di acrilammide

34 Gel di poliacrilammide di sequenza

35 Descrizione generale esercitazioni di laboratorio
Studio della localizzazione intracellulare della proteina SEC4 del lievito Saccaromyces cerevisiae Clonaggio di SEC4 in vettore per l'espressione in lievito di proteine di fusione con "tag" (GFP) Espressione di SEC4 in lievito e analisi della sua localizzazione mediante western blot di estratti frazionati Parte A I) 1. PCR su DNA genomico (preparazione frammento da clonare) 2. Preparazione di DNA plasmidico (vettore di clonaggio) con colonnina 3. Digestione DNA (vettore e frammento) con enzimi di restrizione II) 1. Reazione con enzima "ligasi" 2. Analisi su gel di agarosio 3. Analisi spettrofotometrica del DNA preparato 4. Trasformazione batterica 5. Preparazione piastre di agar III) 1. Analisi risultati trasformazione 2. Minipreparazione DNA plasmidico 3. Analisi su gel di agarosio

36 Clonaggio con doppia digestione
BamHI EcoRI EcoRI BamHI GAATTC CTTAAG  AAGCTT TTCGAA BamHI EcoRI   AGCTT A G CTTAA  DNA ligasi GAATTC CTTAAG AAGCTT TTCGAA