2a DIMENSIONE: SDS PAGE.

Presentazione sul tema: "2a DIMENSIONE: SDS PAGE."— Transcript della presentazione:

1 2a DIMENSIONE: SDS PAGE

2 2a DIMENSIONE: SDS PAGE -EQUILIBRATION - Riduzione e alchilazione -denaturazione con SDS

3 2a DIMENSIONE: SDS PAGE Rf = mobilità relativa delle proteine: rapporto tra la distanza percorsa dalla proteina rispetto a quella percorsa dal colorante

4 GEL 2D GEL 1D 2

5 METODI DI DETECTION Caratteristiche -Sensibilità -Range dinamico -Riproducibilità -Variabilità (proteina-proteina) - Compatibilità con le analisi successive Metodi Coloranti anionici: Coomassie BB Silver stain Isotopi radioattivi Fluorescenza

6 METODI DI DETECTION .

7 Altri metodi ( immunodetection, coloranti fluorescenti)
OVERVIEW Coomassie blue, semplice riproducibile, buon range dinamico, poco sensibile, metodo di Bradford. Silver staining, step multipli, range dinamico variabile, sensibile (AgNo3 si lega a specifici residui proteici, gli ioni argento vengono ridotti ad argento metallico e quindi nella forma visibile per azione della formaldeide a pH alcalino (MS compatibile) Sypro ruby (semplice, buon range dinamico, molto sensible ma poco conveniente) Coloranti specifici per particolari proteine (molto sensibili ) (ProQ Esmerald glycoprotein stain; ProQ Diamond Phoshoprotein stain) Altri metodi ( immunodetection, coloranti fluorescenti)

8 IDENTIFICAZIONE DI PROTEINE DA GEL
Excisione della spot da gel Estrazione della proteina e digestione con tripsina Analisi dei frammenti triptici tramite spettrometria di massa Confronto dei frammenti con digeriti teorici presenti nei database

9 apolipoprotein Spot SSP 1106
Match to: gi|178775Score: 93Expect: 6.6e-05 Nominal mass (Mr): 28944 Calculated pI value: 5.45 Sequence Coverage: 31% 1 RHFWQQDEPP QSPWDRVKDL ATVYVDVLKD SGRDYVSQFE GSALGKQLNL 51 KLLDNWDSVT STFSKLREQL GPVTQEFWDN LEKETEGLRQ EMSKDLEEVK 101 AKVQPYLDDF QKKWQEEMEL YRQKVEPLRA ELQEGARQKL HELQEKLSPL 151 GEEMRDRARA HVDALRTHLA PYSDELRQRL AARLEALKEN GGARLAEYHA 201 KATEHLSTLS EKAKPALEDL RQGLLPVLES FKVSFLSALE EYTKKLNTQ Fixed modifications: Carbamidomethyl (C) Variable modifications: Oxidation (M) Cleavage by Trypsin: cuts C-term side of KR unless next residue is P Number of mass values searched: 22 Number of mass values matched: 10

10 MODIFICAZIONI POST-TRADUZIONALI
L’elettroforesi bidimensionale è un ottimo metodo di studio per le modificazioni post- traduzionali