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Insegnamento CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE TeCoRe Docente Prof. Daniele Fabbri Laboratori di Scienze Ambientali via S.Alberto, 163

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Presentazione sul tema: "Insegnamento CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE TeCoRe Docente Prof. Daniele Fabbri Laboratori di Scienze Ambientali via S.Alberto, 163"— Transcript della presentazione:

1 Insegnamento CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE TeCoRe Docente Prof. Daniele Fabbri Laboratori di Scienze Ambientali via S.Alberto, 163 Tel Materiale didattico Rubinson and Rubinson, Chimica Analitica Strumentale, Fifield and Kealey, Chimica Analitica, teoria e pratica, Lucidi: disponibili on-line o presso portineria sede.

2 PROGRAMMA PARTE PRIMA. Fasi di un procedimento analitico Valutazione del metodo analitico. Campionamento e preparazione del campione Analisi quantitativa PARTE SECONDA Spettrometria atomica: FAAS GFAAS, HGAAS,ICP-AES, ICP-MS. LABORATORI strumenti di indagine bibliografica - uso banche dati Analisi metalli assorbimento atomico. Calibrazione esterna. Analisi acidi grassi gas cromatografia. Calibrazione interna. Elaborazione dati (EXCELL) ESAME Orale. Discussione esercitazione in biblioteca (articolo scientifico ottenuto da una ricerca bibliografica). Discussione esercitazioni di laboratorio (relazioni). Domande sul programma.

3 lot campione : porzione di materiale selezionato per rappresentare un corpo più esteso di materiale. sub-sample : porzione del campione ottenuto per suddivisione o selezione. campione del laboratorio : materiale inviato al laboratorio per le analisi campione test : campione preparato partendo dal campione di laboratorio test portion : il materiale pesato e sottoposto all’analisi. soluzione di misura PREPARAZIONE DEL CAMPIONE TRATTAMENTO DEL CAMPIONE CAMPIONE materiale per il quale è richiesta un’informazione analitica

4  RAPPRESENTATIVO: la composizione è, nella sua globalità, identica a quella del materiale di partenza.  OMOGENEO: la composizione è la medesima in tutte le sue parti.  INTEGRO: non ci devono essere alterazioni durante il trasporto, la conservazione ….(adsorbimento, volatilizzazione, …) altrimenti non si può mettere in relazione il risultato finale con il materiale originale, non importa quanto accurata sia l’analisi Il campione deve essere:

5 Specificare l’identità dell’analita. nome comune nome commerciale nome IUPAC Chemical Abstract Registry Number (CA RN) formula di struttura nome della miscela, presenza di isomeri, sottoprodotti…? DDT p,p’-DDT diclorodifeniltricloroetano 1,1,1-tricloro-2,2-bis(4-clorofenil)etano(IUPAC) 1,1’-(2,2,2-tricloroetilidene)bis[4-clorobenzene](CA) CA RN Trade Names: Agritan, Anofex, Arkotine, ….,Santobane, Zeidane, Zerdane… esempio : struttura molecolare Vedi :esercitazione in biblioteca ANALITA il componente da misurare attraverso l’analisi del campione

6  ANALITAMATRICETRATTAMENTO  inorganicoinorganicadissoluzione-digestione  inorganicoorganicadistruzione sostanza organica  organicoinorganicaestrazione  organicoorganicaestrazione selettiva Analysts are seldom lucky enough to be able to inject samples with no pretreatment RE Majors, LC-GC 2003 MATRICE i componenti del campione chimicamente diversi dall’analita. Il termine MATRICE è usato anche per Indicare le caratteristiche fisiche del campione (solido, liquido, gassoso, organico, inorganico, ecc). La natura della matrice e dell’analita definiscono la procedura di preparazione e trattamento del campione. Esempio:

7 Esempi: Interferenza da PAN nella determinazione NOx nell’atmosfera. [NOx] = [NO] + [NO 2 ] ; PAN = perossiacetilnitrato Si effettua misura NO per chemiluminescenza, dopo che un convertitore ha trasformato NO 2 in NO. Il convertitore trasforma anche il PAN in NO. Interferenza trascurabile nelle zone urbane ([NOx] >> [PAN]), significativa nelle zone rurali ([NOx]max). Interferenza dei cloruri nella determinazione ICP-MS dell’arsenico. Il cloruro produce nel plasma lo ione 40 Ar 35 Cl + isobaro con 75 As +. INTERFERENZA effetto indesiderato di un componente sulla accuratezza della misura di un altro componente. CONTAMINAZIONE introduzione non intenzionale dell’analita o di altre specie nel campione possibile causa di errore nella determinazione. Spesso è irriproducibile ed erratica. Esempio: lavaggio della vetreria inadeguato per l’analisi di metalli in tracce.

8 GLI ERRORI La storia contaminata. Concentrazioni di piombo nell’acqua di mare pubblicate dal 1938 al tratta da M.Stoeppler Ed. Sampling and Sample Prep., Springer ng / l anno

9 Errori casuali : originati da processi incontrollabili e indeterminati, riducibili (ma non eliminabili) con un lavoro attento, presentano variazioni positive e negative, misurati dalla deviazione standard s. Minore il contributo degli errori casuali, più precisa la procedura. Errori sistematici (determinati): originati da cause determinate con lo stesso andamento (positivo o negativo), in principio eliminabili. Misurati dal bias. Errori grossolani. Errori di calcolo, lettura, ….

10 RISULTATO il valore finale riportato per una quantità misurata o calcolata dopo avere effettuato la procedura di misurazione comprese le opportune valutazioni. numero + unità di misura + incertezza ESEMPIO: valore medio Xm ± deviazione standard s, n (numero di misure) stima del valore ± stima della “precisione”, n Cifre significative: Le cifre note con certezza più la prima cifra incerta (qualunque sia la posizione della virgola).l L’errore di una misura è rappresentato dall’errore sull’ultima cifra. Gli zeri a destra delle cifre significative sono significativi (se dopo la virgola), a sinistra no (indicano l’ordine di grandezza) tre cifre significative 650tre o due cifre significative, meglio usare la notazione scientifica: 6.50·10 2 oppure 6.5·10 2

11 definizione dell’informazione desiderata scelta del metodo strategia di campionamento campionamento omogeneizzazione conservazione … pretrattamento: eliminazione interferenti forma idonea per l’analisi determinazione -bianco - calibrazione - campione - RM, CRM convertire i dati in risultati numerici interpretazione dei risultati subsampling campione per il laboratorio aliquote per le analisi ricerca bibliografica LA PROCEDURA ANALITICA

12 fotodegradazione ossidazione rilascio di contaminanti volatilizzazione attività microbica adsorbimento reazioni chimiche CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE

13  Trasformare analita/matrice nella forma più adatta alla tecnica d’analisi  Rimuovere interferenti  Ottenere concentrazione ottimale  Evitare contaminazione.  Minimizzare perdite Durante il trattamento del campione si possono avere perdite di analita. La capacità della procedura analitica di misurare la quantità reale di analita presente inizialmente nel campione è espressa dal recupero (recovery): R, recupero % = C misurata /C attesa ·100 = Q misurata /Q attesa ·100 La concentrazione C (o quantità Q) di analita attesa può essere ottenuta dal valore certificato di un CRM, oppure stabilita preparando un campione fortificato. Il valore ideale è R = 100% Se R < 100% possibili cause: perdite durante le fasi di trattamento (filtrazione, ecc.) Se R > 100% possibili cause: contaminazione. TRATTAMENTO DEL CAMPIONE

14 METALLI Matrice : acqua Filtrazione. preconcentrazione: complessare il metallo con un legante organico per estrarlo in un solvente organico. Matrice: solida digestione: trattamento con acidi forti concentrati a caldo; bomba per digestione se si formano prodotti volatili; digestione assistita da microonde (T< 200°C) Acidi utilizzati: HNO 3, H 2 SO 4, HClO 4 : ossidanti, precauzioni se organici elevato. HCl: complessante, in miscela con altri acidi. HF: disgregazione totale silicati; per analisi concentrazione totale. ORGANICI estrazione. (biota dopo saponificazione; sedimenti); a riflusso; soxhlet; estrazione accelerata con solvente (ASE T>, P>, t<, V<); con fluidi supercritici (SFE; es.CO 2 ). cromatografia su colonna; per eliminare interferenti. Esempi di trattamento del campione

15 criteri per la scelta del metodo analitico FIGURE DI MERITO precisione accuratezza (bias) sensibilità limite di rivelabilità selettività intervallo dinamico costi/investimenti durata dell’analisi throughput sicurezza, tossicità reagenti greenness abilità richiesta all’operatore portability ruggdness dimensione del campione

16 VALIDAZIONE è il processo che permette di dimostrare se i risultati ottenuti con il metodo sono affidabili, riproducibili e se il metodo è adatto per l’applicazione richiesta. Può essere effettuata tramite: Confronto con un metodo differente sullo stesso campione (le fonti di errori dovrebbero essere differenti). Confronto con altri laboratori (partecipazione a studi inter-laboratorio). Uso di materiali di riferimento (certificati). Quando validare un metodo Viene sviluppato un nuovo metodo per risolvere un particolare problema. Si intende migliorare un metodo esistente per estenderlo ad un nuovo problema. Il controllo di qualita’ mostra che le prestazioni del metodo stanno cambiando. Si intende valutare la prestazione del laboratorio anche per un metodo esistente, utilizzato da un altro laboratorio, analista, …

17 Reference material (RM): a material or substance, one or more of whose property values are sufficiently homogeneous and well-established to be used for the calibration of an apparatus, for the assessment of a measurement method or for assessing values to materials. Certified reference material (CRM): a reference material, accompained by a certificate, one or more of whose property values are certified by a procedure. This procedure enables the material’s traceability to be established in terms of the SI unit (to be understood as: a mole of a substance…). Each certified value is accompanied by an uncertainty at a stated level of confidence. ISO guide 1991 materiali di riferimento - materiali di riferimento certificati (CRM) Alcuni enti che producono (C)RM ASTM American Society for Testing and Materials BCR Bureau Communitaire de Reference IAEA International Atomic Energy Agency NIST National Institute of Standard and Technology NRC National Research Council of Canada Come scegliere i crm Il materiale di riferimento dovrebbe avere una composizione simile a quella del campione (matrix matching) Contenere l’analita ad una concentrazione simile a quella del campione.

18 Serie: i risultati …Xi… di analisi ripetute usando un solo metodo analitico su un materiale omogeneo n : il numero totale dei valori misurati della serie. Il numero di repliche n va sempre riportato. PRECISIONE concordanza fra misure ripetute Media (aritmetica) : Xm =  Xi / n = (X1 + X2 + X3 + X4) / n indici della precisione (imprecisione) della misura Stima della deviazione standard: s = [  (Xi - Xm) 2 / (n -1)] 1/2 Deviazione standard relativa: s r = s / Xm errore standard della media: s/n 1/2 numero minimo consigliato per una stima utile: n = 6 X1X1 X2X2 X3X3 X4X4 analisi strumentale valori misurati soluzione di misura

19 campione test prelievo porzioni test trattamento soluzione di misura misuracalcoli valore misurato X1X1 X2X2 X3X3 X4X4 campione test prelievo porzione test trattamento soluzione di misura misuracalcoli valore misurato X1X1 X2X2 X3X3 X4X4 Esempi di analisi replicate Precisione del metodo

20 Y 1 = Y 2 = Y 3 = Y 4 = Y 5 = Risultato: Y m = ± 0.013n = 5 Calcoli: Y m = s = rsd% = 0.13 % g g g g 20 mL digestione diluizione 2 mL a 10 mL misura conc. rame nella soluzione mg/L mg/L mg/L mg/L Risultato: 75.4 ug /g ± 2.9 ug/g(RSD = 3.8 %) n = 4 oppure 75 ug /g ± 3 ug/g n = 4

21 Ripetibilità : s è riferito allo stesso metodo sullo stesso materiale nelle stesse condizioni (operatore, apparato, laboratorio) dopo brevi intervalli di tempo. Riproducibilità : s è riferito allo stesso metodo sullo stesso materiale in condizioni diverse (operatore, apparato, laboratorio) e/o dopo lunghi intervalli di tempo. tempo Currie and Svehla, Pure and Appl.Chem. 66(1994)595.

22 Valore vero  : valore ideale che si potrebbe ottenere se tutte le cause di errore fossero eliminate e l’intera popolazione fosse campionata. Valore ‘ritenuto vero’ T (accepted reference value; conventional true value) valore attribuito ad una quantità e accettato con un incertezza appropriata per un determinato scopo.). CRM T è il valore certificato materiale FORTIFICATO (spiked) T è il valore stabilito dall’aggiunta dell’analita

23 ACCURATEZZA (accuracy): concordanza tra il risultato ed il valore ‘vero’ T L’accuratezza è un concetto qualitativo. Una misura è accurata quando è precisa e libera da bias. ESATTEZZA (trueness): vicinanza di accordo tra il valore medio Xm ottenuto da una serie grande di misure e . ACCURATEZZA ESATTEZZA diminuita da errori sistematici PRECISIONE diminuita da errori casuali

24 Currie and Svehla, Pure and Appl.Chem. 66(1994)595. Errore del risultato :Ei = Xi - T Errore relativo:Er = E / T Errore relativo percentualeEr(%) = E/T100 BIASE = Xm - T Ei = (Xi - Xm) + (Xm -T) = Ecasuale + Esistematico(bias) In questo caso l’accuratezza indica una combinazione di errori casuali e sistematici.

25 valore misurato media laboratorio valore vero bias totale media inter-laboratorio bias del lab bias del metodo Bias del metodo: tipico del metodo, l’errore si presenta in qualsiasi laboratorio; corrisponde al bias di un test inter- laboratorio. Bias del laboratorio: comprende il bias del metodo e il bias inerente al dato laboratorio.

26 CALIBRAZIONE insieme di operazioni che stabiliscono, sotto condizioni specificate, le relazioni tra i valori delle quantità indicate da un sistema di misura e i valori corrispondenti realizzati da uno standard. STANDARD di CALIBRAZIONE materiale con valori noti della quantità Qst da misurare. Esempio: composto puro in un solvente. STRUMENTO DI MISURA segnale Yst Qst CAMPIONE STRUMENTO DI MISURA segnale Yc Qc RELAZIONE Q - Y CONFRONTO. Calibration is comparison Nota bene: non confondere CALIBRAZIONE (= relazione tra segnale e misurando) e TARATURA (= accertamento funzionalità di uno strumento).

27 preparazione (ottenimento) degli standard analisi degli standard produrre il modello di calibrazione analisi dei campioni applicare il modello di calibrazione ai dati dei campioni ricalibrare regolarmente PROTOCOLLO DI CALIBRAZIONE Il modello di calibrazione viene utilizzato per ricavare il valore di C del campione utilizzando la funzione inversa: MODELLO ANALITICO. X = Y - b / a Y = aX + b

28 diluizioni seriali misura stock solution 1000 mg Cu / L1 mL qb a 100 mL 1 mL qb a 200 mL 50.0 ugCu / Lsolvente 0 uL uL 100 uL+ 900 uL 250 uL+ 750 uL 500 uL+ 500 uL 750 uL+ 250 uL 1000 uL+ 0 uL soluzioni di calibrazione bianco 5.00 ug/L 12.5 ug/L 25.0 ug/L 37.5 ug/L 50.0 ug/L segnale Y Y = *C R2 = modello di calibrazione PROTOCOLLO DI CALIBRAZIONE

29 campione test prelievo porzione test trattamento soluzione di misura misura segnale Y = *C ug/L C = (Y ) / modello di calibrazione modello analitico ANALISI CAMPIONE

30 la curva di calibrazione INTERVALLO DINAMICO (dynamic range) del metodo: valori estremi di concentrazione C fra cui si registra una variazione netta del segnale Y al variare di C. INTERVALLO DINAMICO LINEARE: valori di estremi di concentrazione (LOQ-LOL) in cui il segnale Y varia linearmente con la C. Y LOD concentrazione C Yb LOQ LOL intervallo dinamico lineare A valori bassi di concentrazione il segnale è troppo debole; A valori alti di concentrazione si hanno deviazioni dalla proporzionalità (a in genere diminuisce all’aumentare di C).

31 REGRESSIONE LINEARE : l’operazione per ottenere la relazione lineare Yr = b + aCr che meglio interpola i dati sperimentali La retta ottimale è quella che minimiza la somma dei quadrati dei residui :  (Yst - Yr) 2  valore minimo Ym =  Yst / N Cm =  Cst / N Xm, Ym centroide Yst, Xst X Y Yr = aXr + b PENDENZA (sensibilità) a =  (Xst - Xm)(Yst - Ym)/  (Xst-Xm) 2 INTERCETTA b = Xm - aXm Yst, Xst ottenuti dall’analisi di N soluzioni di calibrazione.

32 Con lo sviluppo dei computer l’interpolazione dei punti diventa più semplice. Difficile trovare equazioni su basi teoriche teoriche, perché la non-linearità è dovuta a molteplici cause. Relazioni empiriche: Modello di calibrazione polinomiale : Y = b + aC + a’C 2 + a’’C 3 + … problemi: necessita più standard, maggiori difficoltà nella valutazione dell’incertezza, single-point calibration : La calibrazione più semplice è quella in cui si usa un solo standard): Yst, Xst. Si assume Y = 0 per X = 0; risposta lineare da X = 0 a X = Xst (estrapolazione oltre i valori Yst, Xst sconsigliata). il modello di calibrazione Modello di calibrazione lineare : Y = aC + b = SC + Y b I chimici hanno favorito metodi con relazioni lineari, causa difficoltà ad interpolare curve. Ci sono metodi analitici non-lineari (saggi immunologici).

33 .S = dY / dX pendenza della retta di calibrazione Y = a C + b SENSIBILITÀ costante di propozionalità tra il segnale ed il misurando è una misura dell’abilità di un metodo di distiguere piccole differenze di concentrazioni dell’analita. Y metodo più sensibile C metodo meno sensibile

34 linee analitiche del Si nell’intervallo nm curve di calibrazione lineari per ogni linea analitica. Analisi del Si tramite AAS La sensibilità dipende dalla scelta della di misura lunghezza d’onda, nm intensità relativa concentrazione Si, mg/L assorbanza esempio

35 standard esterno analita nella soluzione di calbrazione misurato separatamente dal campione. Il campione contenente quantità ignote di analita e le soluzioni di calibrazione contenenti quantità note di analita standard sono separate. Soluzioni di calibrazione preparate per diluizioni seriali da una soluzione madre concentrata. Composizione soluzione di calibrazione simile alla soluzione del campione ?  matrix matching Soluzioni del bianco. Es. solvente puro (es. H 2 O), azzeramento dello strumento. Soluzione del bianco procedurale (dei reagenti): contiene tutte le sostanze usate nella preparazione del campione alla stessa concentrazione della soluzione di misura (il valore va sottratto da quello del campione). (es. soluzioni di HNO 3 /HCl) Matrix blank solution: contiene anche i costituenti della matrice (es. sedimento). CALIBRAZIONE ESTERNA

36 standard interno sostanza differente ma simile all’analita (surrogato: comportamento simile a quello dell’analita). può essere aggiunto al campione nella fase iniziale della procedura, in fasi successive o nella soluzione di misura. Scopo: controllare un passaggio critico causa di elevata incertezza. Rapporto [analita]/[surrogato] meglio di [analita] solo Fattore di risposta F = [analita]Ys/[surrogato]Ya Esempi surrogato: Cd per Tl,Pd per Pt spettroscopia atomica 57 Co (radioattivo) per 59 Co analisi radiochimica composto organico marcato con 2 H, 13 C analisi MS appartenente alla stessa classe (CH 3 (CH 2 ) 17 COOH per acidi grassi) CALIBRAZIONE INTERNA

37 Preparazione delle soluzioni di calibrazione. Lo standard interno si trova alla stessa concentrazione in tutte le soluzioni (e lo sarà nella soluzione campione), mentre la concentrazione dell’analita varia. soluzione di standard interno soluzione di analita solvente area analita / area s.i. concentrazione analita standardizzazione interna Qs.i. (area analita / area s.i.) Quantità di analita Q analita

38 RUMORE DI FONDO: variazione indesiderata del segnale, casuale e dipendente dal tempo (noise); segnale non dovuto all’analita, costante o lentamente variabile (deriva) (background). BIANCO: campione che non contiene analita deliberatamente aggiunto, ma contiene tutti i (o alcuni dei) componenti della procedura analitica. N noise misurato come differenza tra il valore più alto e quello più basso (da picco a picco) oppure come valore medio. Y tempo N Rapporto segnale su rumore : S / N tempo S analisi del bianco analisi del campione S segnale (altezza del picco). Y

39 LOD - LIMITE DI RIVELAZIONE (limite di rivelabilità, limit of detection): la quantità di analita che produce il minimo segnale significativamente diverso da quello del bianco. Y lod = Y b + 3s b f Y lod YbYb SbSb Y Yb segnale del bianco s b deviazione standard del bianco Y lod segnale del campione al LOD Y lod LOD

40 Y tempo N S dal rapporto segnale/rumore S/N LOD quella concentrazione che produce un rapporto segnale su rumore S / N = 3 LOD = 3 · s b / a b + 3s b b Y LOD C dalla retta di calibrazione Y = aC + b dalla retta di calibrazione: Y lod = a LOD + b LOD = (Y lod - b) / a ponendo b  Y b LOD = (Y lod - Y b ) / a sostituendo Y lod con la definizione di LOD: Y lod = Y b + 3s b LOD = 3s b ) / a determinare il LOD

41 Y LOD C metodo 1 metodo 2 Yb  il LOD dipende dagli effetti del fondo e dalla sensibilità (a). LOD = 3s / a LOQ = 10 s / a limite di quantificazione Y = a C + b

42 Selettività : indica quanto il metodo è libero da interferenze. Coefficiente di selettività dell’analita A rispetto l’interferente B : K = Sb / Sa. Specificità : capacità del metodo di distinguere tra l’analita e le altre sostanze. Robustezza (robustness): capacità del metodo di resistere alle variazioni delle condizioni sperimentali.


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