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Le strutture batteriche. Il peptidoglicano (PGN)

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Presentazione sul tema: "Le strutture batteriche. Il peptidoglicano (PGN)"— Transcript della presentazione:

1 Le strutture batteriche

2 Il peptidoglicano (PGN)

3 Il Peptidoglicano (PGN): [1] Il componente principale della parete batterica Responsabile della conformazione e della rigidità della parete

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6 Il Peptidoglicano (PGN): [2]  Preserva l’integrità della cellula batterica L’’inibizione della biosisntesi del PGN, sia attraverso mutazioni, sia attraverso il trattamento con antibiotici, o la rottura della struttura del PGN (lisozima) si accompagna alla lisi della cellula batterica.  Contribuisce al mantenimento di una forma definita  Serve come scaffold per le altre componenti della parete È assente in alcuni batteri: Mycoplasma, Planctomyces e in alcuni ceppi di Rickettsia In Chlamidia, seppur presenti i geni per la biosintesi del PGN, non è stato mai identificato

7 Resistenza del PGN Unica grossa molecola nelle tre direzioni dello spazio Legami  -1,4 particolarmente forti Presenza di zuccheri non comuni (MurNac) Alternanza di aminoacidi D e L risulta in una resistenza maggiore Sembra che tra i vari gruppi peptidici si stabiliscano numerosi legami idrogeno

8 COMPONENTE GLUCIDICA Catene lineare di n unità di un disaccaride: N-acetil-D-glucosammina (NAG) Acido N-acetil-muramico (NAM) COMPONENTE PEPTIDICA Corta catena di aminoacidi (TETRAPEPTIDE) alternati negli stereoisomeri D e L

9 Il Peptidoglicano (PGN)

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11 Il Peptidoglicano (PGN): il legame delle catene peptidiche [1]

12 Il Peptidoglicano (PGN): il legame delle catene peptidiche [2]

13 I tetrapeptidi I tetrapeptidi si legano tra di loro con due modalità principali: 1)DIRETTAMENTE (nei Gram negativi) 2)INDIRETTAMENTE (nei Gram positivi)

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15 Il Peptidoglicano (PGN): [3]  Le catene glicaniche vengono assemblate attraverso l’oligomerizzazione di unità disaccaridiche/peptidiche.  Queste reazioni sono catalizzate da numerosi enzimi e vengono indicate come reazioni di transglicosilazione. È posibile stabilire una lunghezza delle catene glicaniche?  La lunghezza media delle catene varia considerevolmente da batterio a batterio e all’interno della stessa popolazione rispetto alla fase di crescita, alla composizione del mezzo di crescita, presenza/assenza di antibiotici, condizioni di crescita extra/intra cellulari  Nel PGN dei Bacilli, B. subtilis, B. cereus, B. licheniformis, lo sheletro saccaridico ha una lunghezza compresa tra le 50 e le 250 unità saccaridiche  Negli Staphilococchi, S. areus, le catene sembrano essere molto più corte con una lunghezza media di 18 unità

16 Biosintesi del PGN

17  La sintesi del PGN ha luogo in tre diversi compartimenti 1. Fase citoplasmatica 2. Fase di membrana 3. Fase periplasmatica Fase citoplasmatica Sintesi dei precursori di natura saccaridica e proteica Fase di membrana Assemblaggio del glican-pentapeptide e attraversamento della membrana citoplasmatica Fase periplasmatica Polimerizzazione del PGN (reazioni di transglicosilazione) e formazione dei legami crociati (reazioni di transpeptidazione)

18 Fase citoplasmatica (stage I) Sintesi dei precursori di natura saccaridica e proteica Sintesi del NAG Si parte dal fruttosio-6 fosfato e attraverso l’azione coordinata di diversi enzimi si arriva alla formazione del primo substrato attivato del PGN: l’UDP-NAG

19 Fase citoplasmatica (stage I) Sintesi dei precursori di natura saccaridica e proteica Sintesi del NAM UDP-NAM Nucleotide di Park

20 Fase di membrana (stage II) Formazione del glican-pentapeptide e traslocazione nel periplasma Bactoprenolo

21 Fase di membrana (stage III) Polimerizzazione del PGN e formazione dei legami crociati

22 Fase di membrana (stage III) Polimerizzazione del PGN e formazione dei legami crociati  Sintasi mureiniche Enzimi presenti fino a circa 200 copie per cellula batterica Possono essere 1.monofunzionali e quindi agire o come transpeptidasi (TP) o come transglicosilasi (TG) 2.Bifunzionali: hanno attività sia di TP che TG Tutte le sintasi mureiniche sono ancorate alla membrana citoplasmatica grazie a un dominio transmembrana adiacente la regione N-terminale (citoplasma) Il dominio catalitico è presene all’estremità C-terminale Un gruppo specifico di sintasi con attività TP sono le PBPs (penicillin-binding proteins)

23 PBPs in E. coli

24 Il Peptidoglicano (PGN): [4]  Come per l’LPS anche per il PGN esistono numerose modificazioni, che si realizzano sia a carico dello scheletro glucidico, sia a livello della componente proteica. 1. le modificazioni della componente saccaridica possono essere fatte rientrare nelle seguenti categorie: deacetilazione, acetilazione, glicolilazione 2. Le variazioni della componente peptidica (peptide stem) sono ascrivibili a due meccanismi: a) azione degli enzimi Mur (durante la biosintesi) b) fasi tardive della biosintesi: amidazione, acetilazione, idrossilazione, aggancio di gruppi proteici Le maggiori variazioni si osservano a livello dell’aminoacido in terza posizione!

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28 Il Peptidoglicano (PGN): Modificazioni nella componente glicanica

29 Modificazioni nella componente glicanica [1]: la deacetilazione  Osservata inizialmente in ceppi di S. pneumoniae reisistenti all’attività del lisozima: una significativa proporzione dei residui di GlcNAC risulta deacetilata  B cereus, B. anthracis, L. monocytogenes, E. faecalis, H. pylori  In S. pneuomniae è stato identificato il gene responsabile di questa modifica: pgdA (peptidoglycan deacetilase A)  PgdA appartiene a una superfamiglia di proteine: le esterasi saccardidiche di classe 4  I membri di questa famiglia presentano due caratteristiche: 1) vengono espresse come proteine con una sequenza segnale di taglio; 2) necessitano, per l’attivazione, del legame a ioni (Zn, Co, Mg)

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31 Qual è il ruolo biologico della deacetilazione del PGN?  La presenza di amminozuccheri deacetilati nella composizione del PGN riduce drasticamente l’attività del lisozima  Lisozima: enzima con attività muramidasica ubiquitariamente presente nei liquidi corporei e nelle secrezioni, nei fagociti (granuli), cellule del Paneth

32 Qual è il ruolo biologico della deacetilazione del PGN?  È possibile che l’effetto della deacetilazione del PGN non sia limitato alla riduzione dell’attività enzimatica del lisozima  La deacetilazione introduce cariche positive nella parete cellulare con conseguente modulazione dei legami con altre strutture batteriche di superficie (proteine) o altri componenti batterici (capsula polisaccaridica)  Maggiore resistenza del batterio ai peptidi cationici antimicrobici (AMPs)) dell’ospite  La deacetilazione può alterare/modulare il riconoscimento di un patogeno attraverso i PRRs: L. monocytogenes, mutante pgdA risposta interferonica (IFN-  ) attraverso il riconoscimento mediato da TLR2 e NOD1

33 Modificazioni nella componente glicanica [2]: la glicolilazione del MurNAC  Osservata inizialmente in ceppi di M. smegmatis  Rappresenta un marker di molti generi batterici appartenenti al phylum degli Actinobatteri (Gordonia, Nocardia, Rhodococcus)  L’aggiunta di un ulteriore gruppo idrossile si realizza durante il pathway biosintetico del PGN

34 Qual è il ruolo biologico della glicolilazione del PGN?  Il gruppo idrossilico sembra partecipare alla formazione di nuovi legami idrogeno con componenti della parete, conferendo maggiore stabilità e resistenza alla parete stessa  Mutanti di M smegmatis nel gene namH sono più suscettibile all’azione del lisozima e degli antibiotici  -lattamici

35 Modificazioni nella componente glicanica [3]: l’acetilazione del MurNAC  Aggiunta di un secondo gruppo idrossilico al C6 con formazione di un residuo di diacetil muramico  L’acetilazione del residuo di MurNAC è la modificazione che si presenta con maggiore frequenza nei Gram positivi e negativi  Il grado di acetilazione del residuo di MurNAC varia considerevolmente tra le specie batteriche e tra i diversi ceppi batterici (dal 20 al 70%)

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37  Gene oatA (O-acetil transferasi) di S. aureus e adrA di S. pneumoniae  Enzimi transmembrana (11 regioni predette transmembrana) con la regione carbossi-terminale extra-citoplasmatica con attività catalitica Modificazioni nella componente glicanica [3]: l’acetilazione del MurNAC

38 Qual è il ruolo biologico dell’acetilazione del PGN?  Maggiore resistenza all’azione del lisozima  Negli Staphilococchi sembra esserci una chiara correlazione tra patogenicità, resistenza all’attività muramidasica del lisozima e grado di acetilazione del MurNAC  Persistenza di frammenti di PGN con residui di MurNAC acetilati: modulazione del riconoscimento dei patogeni da parte del sistema immunitario innato  Il grado di acetilazione dei residui di MurNAC sembra essere ridotto in seguito al trattamento con antibiotici  -lattamici (Neisseria spp., S. aureus, P. mirabilis)  In N. gonorrhoeae esiste una proporzionalità diretta tra il grado di acetilazione del MurNAC e l’attività della carbossipeptidasi PBP2

39 Il Peptidoglicano (PGN): [5]  La componente peptidica rappresenta il punto di ancoraggio di proteine della parete cellulare al PGN: nei batteri Gram negativi, la lipoproteina di Brown CH 2 CH CH 2 S Cys OONH (aa) 56 Lys NH 2 COOH PEPTIDOGLICANO XXXXXXXXXXXXXX GlcNAc MurNAc XXXXXXXXXXXXXXXXXX D-Ala L-Ala D-Glu m-Dap NH 2

40 Il Peptidoglicano (PGN): [6]  La componente peptidica rappresenta il punto di ancoraggio di proteine della parete cellulare al PGN: nei batteri Gram negativi, la lipoproteina di Brown  Il legame della BLP al PGN avviene attraverso reazioni di transpeptidazione  Nei batteri Gram positivi ancorate al PGN numerose componenti. Le reazioni di ancoraggio sono catalizzate dalla SortasiA

41 Metabolismo del PGN Gram positivi: le unità neosintetizzate vengono inserite nel versante interno, prima che la degradazione possa iniziare (INSIDE TO OUTSIDE) Gram negativi: tre nuovi filamenti vengono inseriti contemporaneamente alla rimozione di un filamento vecchio (THREE FOR ONE)

42 “Three for one”

43 Complesso “Yin-Yang” Complesso multienzimatico che combina l’attività di: -Transglicosilasi litiche (LT) -Endopeptidasi (EP) -Amidasi (AM) -Transpeptidasi (TP) -Transglicosilasi (TG)

44 Processo di recycling nei Gram- Durante la crescita batterica, circa il 40-50% del PGN viene degradata nel corso di ogni generazione I prodotti di turnover si accumulano nello spazio periplasmatico Il 90% dei prodotti di turnover viene riciclato e reincorporato nel sacculo stesso Il 10% del materiale degradato viene rilasciato nell’ambiente

45 “Three for one”

46 Membrana esterna Membrana interna UDP-NAM – pentapeptide MurF D-Ala – D-Ala UDP-NAM – D-Ala – L-Glu – meso-DAP Mpl murein peptide ligase UDP-NAM CITOPLASMA L-Ala – D-Glu – meso-DAP – D-Ala LdcA L,D-carboxypeptidase NAG – anh-NAM – L-Ala – D-Glu – meso-DAP – D-Ala AmpD anhMurNAc-Lala amidase LdcA L,D-carboxypeptidase NagZ Β -N-acetyl- glucosamidase PERIPLASMA MUREINA ANHYDRO MUROPEPTIDE TETRAPEPTIDE TRIPEPTIDE Opp oligopeptide permease L-Ala – D-Glu-meso-DAP L-Ala – D-Glu meso-DAP, AmiB, AmiC Amidase SltY, MltA, MltB Lytic trasglycosylases AmiA MpaA Murein peptie amidase MppA periplasmic murein peptide binding AmpG muropeptide permease Il PGN: gli enzimi del recycling

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