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Bio-MS lezione 1 1 Atomi: massa atomica e isotopi.

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Presentazione sul tema: "Bio-MS lezione 1 1 Atomi: massa atomica e isotopi."— Transcript della presentazione:

1 Bio-MS lezione 1 1 Atomi: massa atomica e isotopi

2 Bio-MS lezione 1 2 Isotopi

3 Bio-MS lezione 1 3 Massa: definizioni Massa media Massa della molecola basata sulla somma delle masse atomiche medie degli atomi costituenti la molecola stessa. Massa esatta Viene calcolata prendendo in considerazione non le masse medie degli atomi, ma le masse del loro isotopo principale.

4 Bio-MS lezione 1 4 Spettrometria di massa La spettrometria di massa e’ una tecnica che consente di misurare il peso di atomi o molecole. La determinazione della massa, o del peso molecolare e’ sempre utile per individuare l’identita’ di una sostanza. Per effettuare questa analisi bisogna impartire una carica elettrica alla molecola di interesse, cioe’ l’analita, e successivamente misurare come le traiettorie degli ioni risultanti rispondano nel vuoto a varie combinazioni di campi elettrici e magnetici. Per piccole specie molecolari, la ionizzazione e’ facilmente ottenibile bombardando l’analita con un fascio di elettroni. Negli ultimi anni, gli sforzi di molti ricercatori hanno portato alla scoperta di nuove tecniche di ionizzazione in grado di caricare elettricamente molecole estremamente grandi, altrimenti impossibili da ionizzare con metodi tradizionali senza ottenere una totale distruzione del campione John Fenn, Premio Nobel per la chimica 2002

5 Bio-MS lezione 1 5 Spettrometria di massa Per effettuare un’analisi mediante spettrometria di massa bisogna impartire una carica elettrica alla molecola di interesse, cioe’ l’analita, e successivamente misurare come le traiettorie dello ione risultante rispondono nel vuoto a varie combinazioni di campi elettrici e magnetici. Le traiettorie degli ioni dipendono dal loro rapporto massa/carica m/z

6 Bio-MS lezione 1 6 Generazione di ioni Separazione delle componenti Rilevamento delle componenti separate Lo spettrometro di massa: un prisma molecolare

7 Bio-MS lezione 1 7 ? Spettro di massa

8 Bio-MS lezione 1 8 Bromobenzene Spettri EI: esempi

9 Bio-MS lezione 1 9 Componenti di uno spettrometro di massa Camera di ionizzazione Analizzatore Rivelatore Analizzatore a tempo di volo(TOF), quadrupolo (Q) Fotomoltiplicatore, elettromoltiplicatore EI, MALDI, ESI

10 Bio-MS lezione 1 10 Ionizzazione Condizione necessaria all’analisi spettrometrica e’ la generazione di specie cariche in fase gassosa. Tale processo e’ detto ionizzazione. Il processo richiede energia Costruito il primo spettrometro di massa EI ESI MALDI CI

11 Bio-MS lezione 1 11 Metodi di ionizzazione (1) Protonazione Deprotonazione M + H +  [M+H] + M - H +  [M-H] - - O O + NH 3 Proteine, peptidi, ammine Oligonucleotidi, acidi carbossilici

12 Bio-MS lezione 1 12 Espulsione di elettroni Addizione cationica M  M +. M + Na +  [M+Na] + - e - Metodi di ionizzazione (2) CH 3 +. OH Na + Piccole molecole organiche Carboidrati

13 Bio-MS lezione 1 13 Metodi di ionizzazione a confronto [M+H] + [M-H] - [M+Na] + [M-e - ] + Applicabile a molti composti Ottenibile attraverso diversi metodi di ionizzazione (ESI, MALDI, FAB, APCI) Non applicabile nell’ analisi di carboidrati Non applicabile nell’analisi di idrocarburi Non universale quanto la protonazione Maggiore specificita’ e sensibilita’ rispetto alla protonazione Utile nell’analisi di molecole acide tramite FAB, ESI, MALDI, APCI Applicabile all’analisi di carboidrati e molti tipi di polimeri sintetici Ottenibile attraverso diversi metodi di ionizzazione (ESI, MALDI, FAB, APCI) Difficile ottenere informazioni strutturali da molecole ionizzate mediante addizione cationica Spesso genera frammentazione troppo estesa Non applicabile a biomolecole Puo’ contemporaneamente fornire ionizzazione della molecola di interesse + frammentazione della stessa Vasta applicabilita’ nel caso di molecole volatili. Ottenibile mediante EI ProContro

14 Bio-MS lezione 1 14 Come scegliere la modalità di ionizzazione? Individuare la modalità di ionizzazione più appropriata per l’analisi di un determinato composto è una procedura che si basa essenzialmente su tre fattori Osservazione delle proprietà chimiche della molecola (e.g. proprietà acido- base, presenza di gruppi funzionali, volatilità, etc.) Esperienza (confronto con molecole analizzate con successo nel passato o con dati di letteratura). Verifica pratica (confronto sperimentale tra due o più tecniche di ionizzazione ritenute potenzialmente le più efficaci nella ionizzazione dell’analita in questione).

15 Bio-MS lezione 1 15 Principali tecniche di ionizzazione Ionizzazione “hard” EI (electron impact) Ionizzazioni “soft” MALDI (matrix-assisted laser desorption ionisation) ESI (electrospray ionization) APCI (atmospheric pressure chemical ionization)

16 Bio-MS lezione 1 16 EI: Ionizzazione per impatto elettronico Filamento di tungsteno Fascio di elettroni ad alta energia Repulsore All’analizzatore M +. M M M M Funziona su specie volatili, gia’ presenti allo stato gassoso all’atto della ionizzazione Genera ioni ad alta energia, i quali spesso frammentano molto velocemente in seguito alla ionizzazione Adatta alla ionizzazione di piccole molecole ( < 400 Da)

17 Bio-MS lezione 1 17 EI: Ionizzazione per impatto elettronico m/z Intensita’ EI produce ioni ad alta energia. L’elevata energia interna causa una facile frammentazione dello ione molecolare. I frammenti sono rivelati dallo spettrometro di massa. Essi sono comunque utili per caratterizzazione strutturale (identificazione).

18 Bio-MS lezione 1 18 EI: Ionizzazione per impatto elettronico Gli ioni molecolari generati da EI possiedono un’elevata energia (in genere, vengono utilizzati 70 eV). M  M + - e - Ione molecolare M +  A + + R M +.  A + + N.... La frammentazione dello ione molecolare è un processo spontaneo che avviene per l’eccesso di energia interna dello ione stesso. La frammentazione è determinata dalla struttura molecolare.

19 Bio-MS lezione 1 19 Frammentazione EI: rottura omolitica..

20 Bio-MS lezione 1 20 Frammentazione EI: rottura eterolitica R-X +  R + -X.. +.

21 Bio-MS lezione 1 21 Frammentazione EI: guide generali La frammentazione dello ione molecolare è determinata dalla struttura dello ione stesso (e, di conseguenza, della molecola originaria). In particolare, gli ioni molecolari tendono a: Frammentare in modo da produrre frammenti a bassa energia, quindi relativamente stabili (ad esempio, stabilizzati per risonanza). Liberare piccole molecole neutre (neutral loss) ad elevata stabilità (acqua, idrogeno, acetilene, monossido di carbonio, etc.)

22 Bio-MS lezione 1 22 Benzoato di metile Spettri EI: esempi

23 Bio-MS lezione 1 23 Spettri EI: esempi

24 Bio-MS lezione Riarrangiamento di Mc Lafferty Frammentazione EI: riarrangiamento di McLafferty

25 Bio-MS lezione 1 25 Spettri EI Gli spettri di massa generati da ionizzazione EI sono altamente riproducibili. E’ stato quindi possibile generare banche dati di spettri EI ottenuti sperimentalmente da decine di migliaia di composti organici. L’identificazione di un composto incognito in un campione, quindi, molto spesso si riduce ad una semplice ricerca in banca dati dello spettro EI ottenuto sperimentalmente.

26 Bio-MS lezione 1 26 MALDI: Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization La tecnica e’ basata su un’analisi in fase solida, anche se il campione di partenza e’ in genere in soluzione. L’energia necessaria alla ionizzazione del campione e’ fornita sotto forma di radiazione elettromagnetica. La radiazione e’ inviata in pacchetti ad alta intensita’ tramite un impulso laser

27 Bio-MS lezione 1 27 MALDI: Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Matrice Campione (proteina,peptide, acido nucleico, zucchero) Laser ad azoto, emissione a 337 nm (UV) OH HO COOH HO H CN COOH DHBCHCA Acido 2,5-diidrossi benzoicoAcido α-cian-4- idrossicinnamico

28 Bio-MS lezione 1 28 MALDI- preparazione del campione Piastra metallica per la deposizione del campione e l’analisi Soluzione di matriceSoluzione campione Miscelare (la matrice e’ in forte eccesso) Depositare sulla piastra metallica (1 μL) Lasciare cristallizzare Piastra metallica

29 Bio-MS lezione MALDI: Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Proteina Matrice Impulso laser + 20 kV All’analizzatore Piastra metallica

30 Bio-MS lezione 1 30 MALDI: Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization DNA/RNA Matrice Impulso laser - 20 kV All’analizzatore Piastra metallica - - -

31 Bio-MS lezione 1 31 MALDI: meccanismo di ionizzazione Il processo di ionizzazione MALDI sembra non essere basato su un singolo meccanismo. A seconda delle condizioni sperimentali, possono avvenire differenti processi di ionizzazione. La esistenza di ioni pre-esistenti nei cristalli di matrice è stata dimostrata sperimentalmente. La sublimazione della matrice con conseguente liberazione in fase gassosa degli ioni pre-formati è una delle vie di ionizzazione del MALDI. Il trasferimento di protoni dalla matrice all’analita negli istanti immediatamente successivi al desorbimento è ritenuto un altro meccanismo responsabile della ionizzazione di analiti basici. Nel caso di sostanze capaci di assorbire la luce UV, è anche possibile la fotoionizzazione diretta del campione, con la formazione di ioni radicalici (generalmente non di interesse nel caso delle biomolecole).

32 Bio-MS lezione 1 32 MALDI: Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization m/z % Intensity Genera per lo piu’ specie monocarica Buona tolleranza a contaminanti e sali Capace di ionizzare proteine (> 300 kDa) 6966

33 Bio-MS lezione 1 33 MALDI: Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization m/z % Intensity Genera per lo piu’ specie monocarica Buona tolleranza a contaminanti e Sali Capace di ionizzare proteine (> 300 kDa) 6966 [M+H] + [M+2H] 2+ [M+3H] 3+

34 Bio-MS lezione 1 34 Elettrospray - ESI La tecnica e’ basata sulla nebulizzazione di una soluzione contenente il campione da analizzare. L’energia di ionizzazione e’ fornita da un campo elettrico generato tra l’ago di introduzione del campione e lo spettrometro di massa.

35 Bio-MS lezione MS inlet Alimentatore Menisco Elettrospray - ESI Nessun campo elettrico tra l’ago e lo spettrometro Ionizzazione assente

36 Bio-MS lezione Polo positivo Polo negativo MS inlet Alimentatore Campo elettrico insufficienteIonizzazione assente +- Modalita’ ionizzazione positiva V+ 50 V Elettrospray - ESI

37 Bio-MS lezione MS inlet Alimentatore Polo positivo Polo negativo Campo elettrico sufficienteIonizzazione V+ 50 V +- Elettrospray - ESI Si chiude un vero e proprio circuito elettrico

38 Bio-MS lezione 1 38 Elettrospray - ESI Goccia generata da elettrospray Ion evaporation model (IEM) Charge residue model (CRM) Progressive droplet shrinkage and droplet fissions

39 Bio-MS lezione 1 39 Elettrospray - ESI Ion evaporation model (IEM) Charge residue model (CRM) Evidenze sperimentali hanno dimostrato che IEM è il meccanismo principale attraverso il quale piccole molecole e peptidi vengono ionizzati mediante elettrospray. Il meccanismo CRM sembra essere quello prevalente nel consentire la ionizzazione delle macromolecole e dei complessi proteici.

40 Bio-MS lezione 1 40 L’elettrospray genera ioni multicarica La ionizzazione mediante elettrospray di una soluzione contenente una singola proteina generera’ un segnale multiplo allo spettrometro di massa, dovuto al fenomeno della formazione di ioni multicarica. Goccia generata da elettrospray La goccia evapora lungo il tragitto che porta allo spettrometro. La proteina ionizzata entra nello spettrometro di massa

41 Bio-MS lezione 1 41 Ioni multicarica m/z Intensita’ relativa (%) Massa Carica m/z M 2+ M 3+ M 4+

42 Bio-MS lezione m/z Intensity, counts ESI di una proteina intatta

43 Bio-MS lezione m/z Intensity, counts ESI : interleuchina La proteina ha un peso molecolare di circa 21 kDa. La ionizzazione ESI impartisce da 10 a 30 cariche alla molecola = = M+n M+n+1 n+1 n

44 Bio-MS lezione 1 44 MALDI & ESI: interleuchina m/z % intensity m/z % Intensity MALDI ESI Mw=20904 Mw=20899

45 Bio-MS lezione 1 45 ESI: sommario Capace di generare complessi molecolari ionizzati in fase gassosa (very soft) Facilmente interfacciabile con LC Interfacciabile con analizzatori capaci di effettuare MS/MS Nessuna interferenza da parte di matrici Suscettibile alla presenza di sali Miscele complesse possono ridurre la sensibilita’ dell’analisi La presenza di ioni multicarica puo’ confondere, specialmente nel caso di miscele complesse Il campione da analizzare deve essere puro (ma abbiamo spesso LC come introduzione del campione) ProContro

46 Bio-MS lezione 1 46 MALDI: sommario Capace di ionizzare biopolimeri fino a 1 MDa (1,000,000) Piu’ tolleranza nei confronti di sali ed impurezze rispetto all’elettrospray Spettro facile da interpretare. Ioni background sotto i 700 m/z escludono l’applicabilita’ del MALDI a piccole molecole (ma…) Condizioni acide possono causare degradazione del campione (raramente osservate in analisi di peptidi). ProContro

47 Bio-MS lezione 1 47 Ionizzazione chimica CH 4 + e > CH e - CH CH > CH 5 + +CH 3. CH CH > C 2 H H 2 + H. M + CH > [M+H] + + CH 4 La ionizzazione chimica (CI) è un processo che può essere sia alternativo all’impatto elettronico per molecole volatili, sia alternativo all’elettrospray come metodo di ionizzazione da fase liquida (in questo caso si parla di APCI). CI rispetto a EI è meno distruttiva, e consente di ionizzare le molecole senza eccessiva frammentazione. La ionizzazione chimica si ottiene mediante la generazione, all’interno dello spazio dove è stato vaporizzato il campione, di specie cariche in grado di donare protoni all’analita. Un esempio di gas utilizzato è il metano. Per prevenire la ionizzazione diretta dell’analita M, il gas donatore di protoni è presente ad una concentrazione (pressione) molto più elevata dell’analita stesso.

48 Bio-MS lezione 1 48 APCI La ionizzazione chimica a pressione atmosferica (APCI) prevede la termonebulizzazione di una soluzione contenente l’analita, seguita dalla ionizzazione chimica mediante il gas di nebulizzazione secondo le reazioni descritte in precedenza (formazione di ioni dal metano o altro gas e reazioni di trasferimento protonico all’analita). Il gas di nebulizzazione è ionizzato inizialmente da una scarica elettrica generata tra il capillare di introduzione del campione e lo spettrometro di massa.

49 Bio-MS lezione 2 49 Componenti di uno spettrometro di massa Camera di ionizzazione Analizzatore Rivelatore La biomolecola da analizzare viene ionizzata (i) mediante irraggiamento laser della biomolecola stessa dispersa in una matrice cristallina (MALDI); (ii) direttamente da una soluzione, nebulizzandola in presenza di un campo elettrico (ESI). Gli ioni vengono separati in base al loro rapporto m/z. La separazione puo’ avvenire attraverso filtri di massa (quadrupoli), facendo viaggiare gli ioni in un tubo di volo (TOF), o confinandoli in trappole ioniche (IT, FTICR). Gli ioni vengono inviati dall’analizzatore al detector, che amplifica la corrente ionica diversi ordini di grandezza, generando impulsi che compongono lo spettro di massa finale.

50 Bio-MS lezione 2 50 Esempio di rivelatore: moltiplicatore di elettroni Uno ione dall’analizzatore 10 6 elettroni Serie di dinodi L’urto di un singolo ione proveniente dall’analizzatore causa una cascata di elettroni. L’impulso elettrico viene successivamente digitalizzato

51 Bio-MS lezione 2 51 Analizzatori: tipologie Tempo di volo (TOF) Quadrupolo (Q, triplo quadrupolo TQ) Trappola ionica (IT, trappola lineare LT) Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance (FTICR) Orpitrap

52 Bio-MS lezione 2 52 Analizzatore a tempo di volo Pusher, kV Rivelatore Ionizzazione Campo elettrico Campione Assenza di campo elettrico E k = ½ mv 2 E el =ezU

53 Bio-MS lezione 2 53 Analizzatore a tempo di volo In un analizzatore a tempo di volo (TOF), gli ioni vengono separati all’interno di uno spazio di 1-2 metri compreso tra la sorgente di ionizzazione ed il rivelatore, detto tubo di volo. Ioni aventi una massa elevata viaggiano nel tubo di volo con velocita’ ridotta, arrivando con ritardo al rivelatore rispetto a ioni piu’ piccoli.

54 Bio-MS lezione 2 54 Spettrometria di massa: caratteristiche Accuratezza Risoluzione Mass range Capacita’ di effettuare MS/MS Velocita’ di scansione

55 Bio-MS lezione 2 55 Accuratezza m/z Intensita’ [M+H] + = 20,900 Mr (exp) = 20,899 Indica quanto il valore di massa calcolato dallo spettrometro si avvicina al valore vero. L’accuratezza si esprime in % o in ppm. Mr (teor) = 20,892 accuratezza = 0.03% (o 300 ppm)

56 Bio-MS lezione 2 56 Accuratezza e precisione Misura precisa ma poco accurata Misura poco precisa ma accurata Misura poco precisa e poco accurata. Misura precisa ed accurata Centro del bersaglio: valore vero

57 Bio-MS lezione 2 57 Risoluzione m/z Intensita’ m/z = 50 m/z = ,900 R = FWHM

58 Bio-MS lezione 2 58 Quadrupolo + (U + (Vcos ωt)) - (U + (Vcos ωt)) Al rivelatore Dalla sorgente

59 Bio-MS lezione 2 59 Quadrupolo m/z 500 m/z 1500 m/z 100 Al rivelatore Dalla sorgente A dati potenziali U e V solo ioni ad un preciso m/z attraverseranno il filtro a quadrupolo

60 Bio-MS lezione 2 60 Quadrupolo Tempo di scansione = 1 sec. m/z Intensita’ Tempo U U/V = costante

61 Bio-MS lezione 2 61 Quadrupolo E’ l’analizzatore di massa piu’ comune. (molto utilizzato in strumenti da banco GC-MS relativamente economici). Separa gli ioni nello spazio a seconda del loro rapporto m/z. Usando il voltaggio appropriato, e’ possibile fare si’ che solo ioni con un determinato m/z attraversino il quadrupolo e raggiungano il rivelatore. Il quadrupolo può essere usato come filtro ionico: possiamo settare i potenziali in modo da fare passare solo ioni aventi un determinato m/z ad un secondo analizzatore di massa o ad una camera di collisione (vedi MS/MS)

62 Bio-MS lezione 2 62 Ionizzazione MALDI TOF Piastra metallica Laser Tempo (m/z) Intensita’ Segnale amplificato Spettrometro MALDI-TOF Rivelatore

63 Bio-MS lezione 2 63 ESI-QqTOF analizzatore ibrido pusher rivelatore ESI m/z Intensita’ Quadrupolo

64 Bio-MS lezione 2 64 Spettrometria di massa in tandem La ionizzazione per EI produce frammentazione degli ioni molecolari. Tali frammenti sono essenziali per ricavare informazioni strutturali sulle molecole analizzate. Al contrario, le tecniche di ionizzazione soft (MALDI, ESI, APCI) non producono frammentazione molecolare. Per ottenere informazioni strutturali sulle biomolecole ionizzate, risulta quindi necessario effettuare MS/MS (spettrometria di massa in tandem).

65 Bio-MS lezione 2 65 Spettrometria di massa in tandem (MS/MS) La spettrometria di massa in tandem consiste nell’effettuare una doppia analisi di massa su un determinato campione. Per fare cio’, e’ possibile utilizzare due analizzatori in serie, o utilizzare lo stesso analizzatore a tempi diversi. m/z Intensita’ m/z MS2: MS/MS su m/z Intensita’ MS1: spettro MS da 0 a 1000 m/z Selezione del picco

66 Bio-MS lezione 2 66 MS/MS su QqTOF pusher Rivelatore Da ESI m/z Relative intensity (%) Full scan MS m/z Relative intensity (%) MS/MS su Q0: selezione Q1: Camera di collisione

67 Bio-MS lezione 2 67 MS/MS su triplo quadrupolo (QQQ) Permette esperimenti di MS/MS. In modalita’ SRM (selected reaction monitoring) fornisce sensibilita’ elevatissime. SRM = uno ione di interesse viene selezionato in continuo in Q1 (il filtro lascia sempre passare solo quello specifico ione), frammentato in Q2, ed uno o piu’ frammenti specifici vengono filtrati da Q3 e mandati al detector. frammentazioneframmenti Q1Q2Q3


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