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Acidi nucleici - 4 presentazione del prof. Ciro Formica Duplicazione del DNA. Perché la duplicazione è semiconservativa; Come lavorano le DNA polimerasi.

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Presentazione sul tema: "Acidi nucleici - 4 presentazione del prof. Ciro Formica Duplicazione del DNA. Perché la duplicazione è semiconservativa; Come lavorano le DNA polimerasi."— Transcript della presentazione:

1 Acidi nucleici - 4 presentazione del prof. Ciro Formica Duplicazione del DNA. Perché la duplicazione è semiconservativa; Come lavorano le DNA polimerasi. Errori durante la duplicazione e modalità di correzione. Descrivere: i meccanismi di duplicazione del DNA il modello a doppia elica di Watson e Crick correlare la sua struttura con le sue funzioni Immagini e testi tratti dai website di: genome.wellcome.ac.uk, dnaftb.org, unipv.it, unimi.it, wikipedia.it, unibs.it, unina.it, uniroma2.it, nih.gov, zanichelli.it, sciencemag.org

2 Duplicazione del DNA proprietàFilamento guida (leading strand) Filamento ritardo (lagging strand) Aggiunta nucleotidi continua (concorde alla forcella) discontinua (opposta alla forcella) Direzione 5 3 Okazaki nucleotidiSI Primer (innesco) sintetizzato da RNA primasi SI Punto di attacco uniconumerosi Telomeri 5-TTAGGG3SI DNA polimerasi proofreading 2 Sul filamento ritardo non si completa lultimo frammento di Okazaki, perciò il cromosoma tende ad accorciarsi, ma i TELOMERI, brevi sequenze alle estremità dei cromosomi 5- TTAGGG3, proteggono dallaccorciamento, ma solo per duplicazioni cellulari, finché la cellula va in APOPTOSI e muore. Lenzima TELOMERASI sintetizza il DNA telomerico perso durante la duplicazione.

3 Attività enzimatiche della DNA polimerasi 3 AttivitàAzione svolta ElicasiSrotola l'elica e taglia i legami a idrogeno tra le basi complementari. Primasi Sintetizza una piccola catena ribonucleotidica (lunghezza 9-10 nucleotidi) -che fa da innesco o primer- necessaria per promuovere laggiunta di altri nucleotidi. Polimerasi Aggiunta di 1 nucleotide per volta al 3' OH della catena in accrescimento Ligasi Unisce i frammenti neosintetizzati (dopo la rimozione enzimatica degli RNA-primer). Nucleasi Corregge gli eventuali errori nell'aggiunta dei nucleotidi Nelle nostre cellule la frequenza di errori nell'incorporazione delle basi è minima, dell'ordine di (un errore ogni miliardo – uno ogni 10 miliardi di basi),.

4 DNA polimerasi innescostampoallungamento catena monomeri primer template5 3dNTP 4

5 replicazione 5

6 replicazione 6 EDITING: Correzione degli errori durante la duplicazione.

7 replicazione 7

8 replicazione 8

9 Bolla di replicazione /11)%20Duplicazione%20DNA.pdf

10 Meselson e Stahl 1958: Modello semiconservativo 10 Le molecole di DNA in un gradiente di densità ottenuto centrifugando a lungo una soluzione di CsCl (cloruro di cesio) galleggiano al livello del gradiente che corrisponde alla loro densità. Per distinguerle, le eliche nuove venivano marcate con 14 N (azoto leggero, meno denso), le vecchie con 15 N (azoto pesante, più denso). Dopo la centrifugazione apparivano dei picchi di densità distinti, che facevano pensare ad una modalità semiconservativa, cioè che ogni doppia elica fosse formata da unemielica vecchia e una nuova

11 La replicazione semiconservativa: A half DNA ladder is a template for copying the whole incubazione dei batteri in 15 N 2- trasferimento in 14 N: la crescita prosegue 3- raccolta campioni a 0, 20 (1 replicazione) e 40 minuti (2 replicazioni) 4- si misura la densità delle nuove molecole di DNA: 0: tutte catene pesanti ( 15 N) 20: tutte catene intermedie 40: metà intermedie, metà leggere ( 14 N) Conclusioni: la replicazione non può essere conservativa (2 catene vecchie o 2 catene nuove) né dispersiva (catene miste). Poiché bastano 2 replicazioni per far sparire le catene pesanti, il quadro è compatibile con la replicazione semiconservativa: 1 catena vecchia e 1 nuova).

12 Matthew Meselson, USA, 1930-vivente 12 Chimico USA, lavorò con Pauling sulle proteine al Caltech. Mediante la cristallografia a r.X evidenziò la struttura proteica. Dimostrò che la ricombinazione dei fagi deriva dallo splicing del DNA. Nel 1960 François Jacob e Sydney Brenner ricavarono nel suo lab al Caltech i dati necessari per dimostrare lesistenza del mRNA. Scoprì le basi enzimatiche del riconoscimento del DNA interno alla cellula e la protezione mediante aggiunta di gruppi metilici CH 3 : la metilazione lascia intatto il proprio DNA, mentre il DNA estraneo viene attaccato dagli enzimi di restrizione. Scoprì anche il processo del riparo degli errori di appaiamento del DNA (mismatch repair), che fa fissare gli errori nel DNA. Dal 1963, Meselson si occupa delle armi chimiche e biologiche come consulente di agenzie governative sulleffetto di questi ordigni.

13 Franklin Stahl, USA, 1929-vivente 13 Conobbe Meselson al corso di biologia molecolare tenuto da Watson e Crick e insieme cercarono di dimostrare la replicazione semiconservativa della DE già ipotizzata dagli stessi Watson and Crick. Lavorarono di comune accordo al Caltech e nel 1957 trovarono le prove sperimentali che cercavano mediante la centrifugazione in gradiente di densità. Dopo la pubblicazione nel 58 il lavoro fu definito "one of the most beautiful experiments in biology." Ancora oggi insegna allUniversità dellOregon e si interessa di ricombinazione genetica

14 Arthur Kornberg, USA, Nacque a Brooklyn da genitori dellEuropa Orientale. Fu uno studente prodigio e dopo la laurea in medicina studiò littero epatico, di cui lui stesso soffriva. Fu assunto al NIH, National Institutes of Health dove diresse la sezione di enzimologia e metabolismo, scoprendo un centinaio di enzimi coinvolti nei processi metabolici. In seguito, come direttore di Microbiologia a St.Louis, scoprì la DNA polimerasi I. Fu insignito del Nobel nel 59 con Severo Ochoa Kornberg for the enzymatic synthesis of DNA, Ochoa for the enzymatic synthesis of RNA. Considerava la scienza unattività creativa, una forma darte e ricavò tanta soddisfazione dalla ricerca. La moglie Sylvy era anche lei ricercatrice e lavorò nel suo lab, il figlio Roger anche lui ricercatore isolò la DNA polimerasi III.

15 Sydney Brenner, Sudafrica, 1918-vivente 15 Per approfondire gli studi di biologia molecolare dovette trasferirsi negli USA, dove collaborò con Watson e Crick. Scoprì lRNA messaggero e dimostrò in che modo viene determinato lordine degli amminoacidi nelle proteine. In seguito ha studiato i geni dei vetrebrati e levoluzione del genoma. I suoi studi hanno permesso di analizzare la sequenza dei geni e hanno contribuito alla crescita del Progetto Genoma. Con le sue ricerche sul vermetto Caenorhabditis elegans sono stati meglio compresi linvecchiamento e la morte cellulare programmata (apoptosi). Nobel nel 2002 con Sulston per gli studi su morte cellulare programmata e regolazione genica nello sviluppo degli organi

16 Paul Zamecnik, USA, Medico USA, si interessò alla biosintesi delle proteine e dimostrò mediante radionuclidi che per la biosintesi è necessario che gli amminoacidi siano attivati energicamente dallATP. Usò un estratto acellulare di fegato di ratto, poi nel 1956 scoprì il fattore di trasporto degli amminoacidi: il tRNA, ladattatore che Crick aveva previsto nel Dogma centrale: DNA RNA PROTEINE. In seguito purificò i tRNA, mentre Nirenberg e Matthaei usarono il suo estratto acellulare di E.coli per ricavare il CODICE GENETICO. Scoprì anche lmRNA antisenso che blocca la traduzione proteica. Dal 1993 studiò nuovi farmaci basati sullidea dei bloccanti anti-senso. He passed away in 2009.

17 Marshall Nirenberg, USA, Zoologo ed ecologista USA, si interessò al CODICE GENETICO. Insieme a Matthaei sintetizzò il primo polinucleotide sintetico, il poliU, dal quale ricavò la fenilalanina: era il primo tassello della decifrazione del CODICE. In seguito sintetizzarono altri polinucleotidi omogenei (poli A, poli,C, poli G) e eterogenei (poli AAG, poli GCC ecc). Scoprì la ridondanza di alcuni amminoacidi (degenerazione del codice) e I segni di punteggiatura (codoni INIZIO e STOP). Comprese anche luniversalità del codice per tutte le specie, tranne poche eccezioni. Nobel 1968 per la fisiologia e la medicina con Khorana e Holley (il primo a determinare sequenza e struttura di un tRNA). Studiò anche il sistema nervoso della Drosophila, il trasporto degli zuccheri nelle cellule tumorali.

18 Har Gobind Khorana, India-USA, Biochimico, studiò il codice genetico e partendo dal poli CU ottenne una definitiva dimostrazione del fatto che il codice fosse a triplette. Abbinò la tripletta CUC allaa. Leucina e UCU alla Serina. Poi proseguì con altre triplette fino alla completa decifrazione del codice. Gli fu assegnato il Nobel con Nirenberg e Holley, per il loro lavoro indipendente "for their interpretation of the genetic code and its function in protein synthesis," In seguito al MIT di Boston riuscì a produrre il primo gene artificiale in un batterio, più tardi sintetizzò il gene della rodopsina, una proteina della retina dellocchio umano, e a scoprire le mutazioni di questo gene che conducono alla retinite pigmentosa. Il suo lavoro fu fondamentale per i successivi sviluppi dellingegneria genetica.

19 mRNA e codice genetico 19 Nirenberg and Khorana did not know the sequence of their synthetic mRNAs. They deduced the sequence by varying the amounts of nucleotides added and calculating the probability of making specific codon sets Perché esiste la ridondanza nel codice genetico, ossia perché il codice è degenerato? Non era preferibile che la natura lasciasse non codificanti i codoni extra? la risposta è più avanti…

20 Il codice genetico UUU Fenilalanina PHE UCU Serina SER UAU Tiroxina TYR UGU Cisteina CYS UUCUCCUACUGC UUA Leucina LEU UCAUAA STOP UGASTOP UUGUCGUAGUGG Triptofano TRP CUUCCU Prolina PRO CAU Istidina HIS CGU Arginina ARG CUCCCCCACCGC CUACCACAA Glutammina GLN CGA CUGCCGCAGCGG AUU Isoleucina ILE ACU Treonina THR AAU Asparagina ASN AGU Serina SER AUCACCAACAGC AUAACAAAA Lisina LYS AGA Arginina ARG AUG Codone inizio ACGAAGAGG GUU Valina VAL GCU Alanina ALA GAU Ac.Aspartico ASP GGU Glicina GLY GUCGCCGACGGC GUAGCAGAA Ac.glutammico GLU GGA GUGGCGGAGGGG

21 Ridondanza o degenerazione del codice genetico 21 Sono codificati da: 6 codoni - arginina, leucina, serina. 4 codoni – alanina, glicina, treonina, prolina, valina 3 codoni – isoleucina 1 codone – metionina (inizio) e triptofano, 2 codoni – tutti gli altri

22 22 Lelevata degenerazione del codice può essere interpretata come un meccanismo di protezione contro le mutazioni di singole basi che fanno assumere ad una tripletta un significato diverso da quello originario, compreso il significato di stop. Se una mutazione produce uno stop (probabilità 1/20) è rischioso perché si interrompe la sintesi della proteina. Gi aminoacidi più degenerati sono più frequentemente presenti nelle proteine, quindi più protetti dal rischio di mutazione. Quelli con uno o pochi codoni sono più rari nelle proteine. La terza posizione del codone viene detta posizione di wobble (tentenamento). In questa posizione, gli U e le C possono essere letti come G nellanticodone nel tRNA. Allo stesso modo, le A e le G possono essere lette come U o Y (pseudouridina) nellanticodone.

23 23 Se il tRNA contiene una Inosina nellanticodone in wobble il tRNA può leggere codoni nel mRNA che hanno A, U oppure C nella terza posizione. Nella figura è rappresentato lesempio della Glicina (Gly)

24 24 Molecola di tRNA con lanticodone di riconoscimento del codone di mRNA nel codice genetico.

25 25 Non sovrapponibiltà delle triplette del codice genetico.

26 26 Risposta al quesito sulla degenerazione del codice in una proteina. Gi aminoacidi più degenerati sono più frequentemente presenti nelle proteine, quindi più protetti dal rischio di mutazione. Quelli con uno o pochi codoni sono generalmente più rari nelle proteine. Ser 3 Leu 6 Arg 1 Ala 1 Gly 4 Thr 2 Pro 1 Val 3 Ile 2 Cys 6 (3 ponti S-S) Trp Met


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