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I metodi sperimentali classici per la risoluzione della struttura tridimensionale di una proteina sono: la cristallografia a raggi X la spettroscopia a.

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Presentazione sul tema: "I metodi sperimentali classici per la risoluzione della struttura tridimensionale di una proteina sono: la cristallografia a raggi X la spettroscopia a."— Transcript della presentazione:

1 i metodi sperimentali classici per la risoluzione della struttura tridimensionale di una proteina sono: la cristallografia a raggi X la spettroscopia a risonanza magnetica e nucleare (Nuclear Magnetic Resonance, NMR) Come si può studiare la struttura di una proteina

2 cellula batterica plasmide DNA esogeno moltiplicazione del clone formazione di cristalli purificazione della proteina diffrazione ai raggi X NMR

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4 Il pattern di diffrazione viene usato per ricostruire le coordinate dei singoli atomi che compongono la macromolecola e quindi la sua struttura 3D. I raggi X interagiscono quasi esclusivamente con gli elettroni presenti nella materia e non con i nuclei. Una struttura ai raggi X è quindi unimmagine della densità elettronica delloggetto in analisi Cristallografia a raggi X La proteina, cristallizzata, viene bombardata con un raggio di fotoni collimati ad alta energia. I fotoni vengono diffratti in modo differente a seconda del tipo di atomo che colpiscono. I raggi diffratti vengono raccolti formando un quadro (pattern) di diffrazione

5 Limiti del metodo: Cristallizzare proteine e` difficile Ricavare la struttura dal pattern di diffrazione e` computazionalmente complesso Linformazione che si ottiene e` statica, mentre la conforomazione di una proteina in soluzione varia nel tempo B factor (fattore di temperatura): indice indiretto di flessibilita strutturale Cristallografia a raggi X Risoluzione ottenibile su piccole molecole organiche 1Å. In generale proteine cristallizate hanno grado di organizzazione più basso che limitano la risoluzione (2- 3.5Å). Questo è dovuto anche allalta idratazione dei cristalli (40-60% di acqua). Una tale risoluzione non è sufficiente per rivelare la posizione dei singoli atomi, ma è sufficiente per tracciare landamento e la disposizione dello scheletro covalente della proteina. Occorre quindi conoscere la sequenza primaria in modo da adattare la mappa della densità elettronica alla sequanza aminoacidica.

6 In un cristallo di proteine, in ogni cella (sito reticolare) si trova una proteina = somma di densità elettroniche dovute ai singoli atomi

7 Il risultato sperimentale diretto di un analisi cristallografica è una mappa di densità elettronica e non il modello atomico che voi state osservando!!! Se vi sono errori nelle strutture cristallografiche questi sono dovuti allinterpretazione (soggettiva) delle mappe elettroniche da parte del cristallografo!!

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10 PARAMETRI X VALUTAZIONE DELLINFORMAZIONE CONTENUTA NELLA STRUTTURA X-RAY: Risoluzione (R) della mappa di densità elettronica (tra 3 e 1.5 Å). Strutture con R > 2.5 Å dettagli solo sul backbone, R < 2 Å dettagli su atomi catene laterali R-value e R-free: parametri associati al livello di discordanza tra modello atomico e mappa di densita elettronica (devono essere R-value < 20% e R-free < 30%). Forniscono, in ultima istanza, indicazioni su quanto differiscono tra loro mappa di densita elettronica osservata (sperimentale) e mappa di densita elettronica calcolata dal modello della struttura finale.

11 Spettroscopia a risonanza magnetica nucleare (NMR) Permette di ottenere informazioni sulla struttura di una molecola attraverso linterazione con una radiazione elettromagnetica. Si basa sullo stesso principio della risonanza magnetica usata in medicina, usa onde radio. È possibile rilevare quando i momenti magnetici dei vari nuclei (che continuano a ruotare) si inclinano completamente sul piano perpendicolare rispetto al campo magnetico applicato grazie ad un'antenna che capta le onde radio che questi generano ed è collocata perpendicolarmente al campo magnetico applicato. I nuclei atomici (elettricamente carichi) ruotano, con una velocità angolare quantizzata, creando un momento magnetico Immersi in un campo magnetico omogeneo esterno i momenti magnetici si allineano (traballando a causa del rumore termico). I nuceli vengono irradiati da onde radio (RF), leffetto è di disallineare (tanto da farli ribaltare).

12 Spettroscopia a risonanza magnetica nucleare (NMR) Caratteristiche: studio delle proteine in soluzione (non occorre cristallizzarle) alta risoluzione temporale (millisecondi) informazioni sulle distanze interprotoniche non precise la proton signature limita il metodo allanalsi di molecole piccole (<30 KD <250 residui) informazioni su strutture di complessi proteici deducibili solo con il ricorso a metodi di modellistica guidati dai dati sperimentali Ogni nucleo mostra le sue caratteristiche perchè ruota a velocità differente a seconda della sua posizione nella molecola e all'ambiente che gli atomi vicini gli fanno sentire e quindi risuona a frequenze radio diverse. Nuclei diversi risuonano a frequenze diverse. Ciò significa innanzitutto che un atomo di carbonio deve essere colpito da un'onda radio con frequenza diversa da quella necessaria ad un atomo di idrogeno per ribaltarsi di 90°, ma anche che atomi simili in ambienti diversi, come un atomo di idrogeno legato ad un atomo di ossigeno ed un atomo di idrogeno legato ad un atomo di carbonio si ribaltano a frequenze diverse. Questo è dovuto alla schermatura degli elettroni vicini

13 HEADER OXYGEN TRANSPORT 22-JAN-98 1A3N TITLE DEOXY HUMAN HEMOGLOBIN COMPND MOL_ID: 1; COMPND 2 MOLECULE: HEMOGLOBIN; COMPND 3 CHAIN: A, B, C, D; COMPND 4 BIOLOGICAL_UNIT: ALPHA-BETA-ALPHA-BETA TETRAMER SOURCE MOL_ID: 1; SOURCE 2 ORGANISM_SCIENTIFIC: HOMO SAPIENS; SOURCE 3 ORGANISM_COMMON: HUMAN; SOURCE 4 TISSUE: BLOOD; SOURCE 5 CELL: RED CELL KEYWDS OXYGEN TRANSPORT, HEME, RESPIRATORY PROTEIN, ERYTHROCYTE EXPDTA X-RAY DIFFRACTION AUTHOR J.TAME,B.VALLONE REVDAT 1 29-APR-98 1A3N 0 REMARK 1 REMARK 2 REMARK 2 RESOLUTION. 1.8 ANGSTROMS. REMARK 3 Esempio: Deossiemoglobina umana (1a3n) […] PDB: banca dati di strutture (Protein Data Bank) – ridondante – strutture ottenute sperimentalmente via X-ray o NMR

14 ATOM 1 N VAL A N ATOM 2 CA VAL A C ATOM 3 C VAL A C ATOM 4 O VAL A O ATOM 5 CB VAL A C ATOM 6 CG1 VAL A C ATOM 7 CG2 VAL A C ATOM 8 N LEU A N ATOM 9 CA LEU A C ATOM 10 C LEU A C ATOM 11 O LEU A O ATOM 12 CB LEU A C ATOM 13 CG LEU A C ATOM 14 CD1 LEU A C ATOM 15 CD2 LEU A C ATOM 16 N SER A N ATOM 17 CA SER A C ATOM 18 C SER A C ATOM 19 O SER A O ATOM 20 CB SER A C ATOM 21 OG SER A O … XYZ coordinate tipo di atomo tipo di amminoacido

15 Come nel confronto di sequenze e necessario allinearle, nel confronto di strutture 3D e necessario sovrapporle come corpi rigidi scegliendo una regola di corrispondenza tra coppie di atomi o di residui nelle due strutture. La prima difficoltà consiste nel fatto che le due proteine molto spesso non hanno lo stesso numero di residui. Per la sovrapposizione si possono utilizzare le catene dei carboni alfa appartenenti agli elementi di struttura secondaria perche in genere le inserzioni e delezioni si accumulano nei loop che possono semplicemente venire esclusi dalla sovrapposizione. I metodi di confronto 3D utilizzano l allineamento delle sequenze per decidere la regola di corrispondenza alla base della sovrapposizione strutturale CONFRONTO STRUTTURE 3D DI PROTEINE – ALLINEAMENTO STRUTTURALE

16 Un allineamento strutturale può essere valutato in base alla deviazione quadratica media (root mean square deviation o r.m.s.d.), al numero di atomi che sono stati accoppiati nella sovrapposizione e alla valutazione della similarità dei residui sovrapposti. Lr.m.s.d. o r.m.s. di una sovrapposizione tridimensionale è la distanza media tra gli atomi di tutte le coppie che hanno partecipato allallineamento strutturale, per cui tanto più bassa è lr.m.s. tanto migliore sarà lallineamento strutturale calcolato D = distanza tra coppie di atomi appaiati N = numero di coppie considerate

17 RMSD Root-mean-square deviation – Deviazione quadratica media – Serve per paragonare strutture identiche, eccetto rotazioni e traslazioni r ai e r bi sono le posizioni dell´ atomo i nelle strutture a e b, n è il numero di atomi nelle strutture. r.m.s.d. di una sovrapposizione 3D è la distanza media tra gli atomi di tutte le coppie che hanno partecipato allallineamento strutturale, per cui tanto più bassa è lr.m.s. tanto migliore sarà lallineamento strutturale calcolato

18 EVOLUZIONE DELLE PROTEINE RELAZIONE ESISTENTE TRA SIMILARITA di sequenza e struttura in omologhi Studio di un campione di strutture note di proteine omologhe (Chothia, Lesk, 1982) Similarità strutturale misurata in termini di RMSD CALCOLO RMS - Confronto di due strutture mediante SOVRAPPOSIZIONE - Determinazione di aa che si corrispondono nelle due strutture - Identificazione degli atomi che si vogliono confrontare (Cα o backbone) RMSD= n = numero residui d = distanza tra atomi corrispondenti

19 un altro criterio di valutazione di un allineamento strutturale è rappresentato dal numero di atomi o di residui che sono stati accoppiati si cerca di massimizzare il numero di atomi accoppiati e di minimizzare la corrispondente r.m.s. a parità di numero di residui accoppiati, il migliore allineamento strutturale sarà quello con minore r.m.s. a parità di r.m.s. verrà considerato migliore lallineamento strutturale operato con un maggior numero di atomi accoppiati valutazione dellallineamento strutturale oltre a questi due valori tipici delle sovrapposizioni tridimensionali, si può anche considerare il punteggio di similarità dei residui accoppiati

20 DIVERGENZA DI SEQUENZA E STRUTTURA Se si valuta la relazione esistente tra divergenza strutturale (misurata in termini di RMSD) e divergenza di sequenza si osserva che esse si corrispondono in MODO ESPONENZIALE (valutato dal confronto di strutture note) - (RMSD< 2 Å) possono avere seq molto differenti (degenerazione del codice strutturale-struttura più conservata della seq) RMSD (A) %identity 30% id.seq

21 SOGLIA di significatività per la SIMILARITA STRUTTURALE. confronto a coppie di struttura e seq di proteine 3D note, quantificato usando come parametri: lunghezza allineamento, % id seq, sim.struttura a confronto in un grafico: lunghezza allin vs id seq (e in terza dimensione sim.strutturale) Sim. Strut.parametrizzata come uguale/diverso (pallino/quadrato): 2 str. Uguali se > 70% della struttura sec è in comune (rmsd bassa). al di sotto della soglia rumore di fondo elevato 25% (x allin 80 aa) al di sopra del quale chiara similarità strutturale – soglia lunghezza dipendente possibile che proteine con identità < 25% abbiano strutture simili ma anche che non siano correlate strutturalmente (twilight zone) %id seq Length alignment Sec str identity < 70% Sec str identity > 70%

22 Dalla sequenza al modello Raw model Loop modeling Side chain placement Refinement

23 HOMOLOGY MODELLING OMOLOGO 3D (PDB) ALLINEAMENTO RICERCA DEL TEMPLATO Blast-FastA -CRITERI IDENTITA/SIMILARITA -CONOSCENZA FUNZ.-STR.-BIOCHIM.

24 ALLINEAMENTO GUIDA LA COSTRUZIONE DEL MODELLO CORRISPONDENZA aa target aa templato ricerca ALLINEAMENTO OTTIMALE CORRISPONDENZA DI aa FUNZ. IMPORTANTI CORRISPONDENZA DELLA STRUTTURA SECONDARIA TRA TEMPLATO E QUERY VALUTAZIONE DEI GAP loop USO TEMPLATI MULTIPLI loc.similarità

25 ALLINEAMENTO 1. Generazione di allineamenti a coppie diversi con diversi programmi (nel caso di un solo templato) 2. Allineamenti multipli di omologhi per avere informazioni maggiori 3. Ricerca di informazioni biologico-biochimiche sugli aa conservati 4. Predizione di struttura secondaria per il target 5. Correzione dellallineamento sulla base delle informazioni ai punti e 4.

26 CREAZIONE DEL MODELLO identificazione SCR (structural conserved regions) SCR scaffold del modello ______________ ______________ x-ray SCRs No SCRs (loops ?) Raw model Loop modeling Side chain placement Refinement

27 Costruzione del pre-modello La struttura del templato viene utilizzata come stampo per costruire il modello seguendo lallineamento. Le coordinate 3D dei residui strutturalmente conservati si possono copiare direttamente. Le regioni variabili della struttura (generalmente loop) non si possono copiare. flexible conserved

28 Catene laterali Problema: Applicando le coordinate del templato sulla sequenza del target cambiano tipo, dimensione e posizione delle catene laterali. LRMSD cambia relativamente poco, però possono cambiare le conformazioni di residui importanti (p.es. del sito attivo) Dove possibile è meglio mantenere le conformazioni delle catene laterali del templato. Esistono metodi standard per risolvere questo problema. Raw model Loop modeling Side chain placement Refinement

29 PREDIZIONE DELLE CATENE LATERALI AUSILIO DI LIBRERIE DI ROTAMERI Contengono i possibili conformeri delle catene laterali a fronte di specifiche conformazioni del backbone OTTIMIZZAZIONE ENERGETICA DELLE STRUTTURA rimozione di clash

30 Loop modeling Al pre-modello possono mancare interi frammenti di catena principale – non conservati nella famiglia proteica – Inserzioni – Delezioni Descrizione del problema: – Si cerca un fold che colleghi il frammento N- terminale (pre-loop) con quello C-terminale (post-loop) tramite k residui – (, ) sono gli unici parametri liberi loop post-loop pre-loop Raw model Loop modeling Side chain placement Refinement

31 PREDIZIONE DEI LOOP REGIONI VARIABILI – pressione selettiva DUE STRATEGIE PREDITTIVE: criterio geometrico testando diverse conformazioni ricerca in PDB di frammenti simili nelle proteine a struttura nota INFLUENZA DELLINTORNO REFINEMENT CRITICO OTTIMIZZAZIONE MEC. E DIN. MOL. CRITICITA nella predizione quando i LOOP rivestono ruolo funzionale o di interazione.

32 5. Ottimizzazione del modello Minimizzazione energetica Regolarizzazione di legami, angoli e torsioni Eliminazioni di clash strutturali


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