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INDICE Bromuro di Etidio Trizol Cloroformio -mercaptoetanolo Guanidina tiocianato Dimetilsulfossido Diaminobenzidina (DAB)

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Presentazione sul tema: "INDICE Bromuro di Etidio Trizol Cloroformio -mercaptoetanolo Guanidina tiocianato Dimetilsulfossido Diaminobenzidina (DAB)"— Transcript della presentazione:

1 INDICE Bromuro di Etidio Trizol Cloroformio -mercaptoetanolo Guanidina tiocianato Dimetilsulfossido Diaminobenzidina (DAB)

2 Elettroforesi Lelettroforesi in gel è il metodo standard utilizzato per separare, identificare e purificare frammenti di DNA Il gel può essere costituito da agarosio o da poliacrilamide I gel di poliacrilamide sono usati per separare frammenti di DNA < 500 bp e hanno unelevata risoluzione, ma sono più difficili e pericolosi da maneggiare rispetto ai gel di agarosio I gel di agarosio sono semplici da preparare e sono tipicamente usati per separare frammenti di dimensioni variabili da poche centinaia di basi a 20 kb. Vengono largamente utilizzati per la maggior parte delle analisi routinarie su DNA/RNA Lagarosio è un polimero di carboidrati estratto dalle alghe. Esso, se fuso e gelificato, forma una matrice, la cui porosità dipende dalla concentrazione dellagarosio

3 Reagenti TBE: tampone più comunemente usato per lelettroforesi T Tris,consente il mantenimento di un valore costante di pH della soluzione E EDTA, chela i cationi bivalenti, come il magnesio. Questo è importante, perché la maggior parte delle nucleasi richiede cationi bivalenti per funzionare B Borico che fornisce lappropriata forza ionica al tampone Bromuro di Etidio Uno dei coloranti più utilizzati è il bromuro di etidio, molecola organica aromatica planare, altamente tossica, cancerogena e mutagena, in grado di intercalarsi tra le basi azotate e di emettere luce arancio se eccitata da radiazione UV con compresa tra 254 e 306 nm. Questo colorante è in grado di evidenziare quantitativi di acidi nucleici fino a 50 ng [Old e Primrose, 1994]

4 Agenti cancerogeni o mutageni In base al Dlgs 626/94 si deve intendere per agente cancerogeno una sostanza o un preparato che, in base alle disposizioni CEE (direttiva 67/548/CEE, direttiva 88/379/CEE) deve riportare la codifica R45 (può provocare il cancro) o R49 (può provocare il cancro per inalazione) Se la sostituzione dellagente cancerogeno non e possibile, dovrà essere utilizzato in un sistema chiuso; in tutti i casi e necessario accertarsi che lesposizione allagente nocivo sia limitata In base allart. 64, qualora si usino agenti cancerogeni si devono applicare le seguenti misure: Limitazione delle quantità nellambiente di lavoro Attuazione delle norme igieniche Massima riduzione possibile del numero di soggetti esposti Raccolta e smaltimento dei residui in condizioni di sicurezza

5 Dispositivi di protezione individuali Occhiali Indumenti di protezione (camice) Guanti protettivi Maschere di protezione Loperatore può proteggersi con mezzi di prevenzione individuale, ma luso di questi non può sostituire luso di una cappa efficiente, ma solo integrarlo, per diminuire ulteriormente il rischio di danni

6 Bromuro di Etidio T + Molto tossico Proprietà fisiche e chimiche Stato: Solido Colore: Rosso scuro Odore: Quasi inodore Frasi-R: /37/38-68 Nocivo per ingestione. Molto tossico per inalazione. Irritante per gli occhi, le vie respiratorie e la pelle. Possibilità di effetti irreversibili Frasi-S: /37-45 In caso di contatto con gli occhi, lavare immediatamente ed abbondantemente con acqua e consultare un medico. In caso di contatto con la pelle lavarsi immediatamente ed abbondantemente con acqua e sapone. Usare indumenti protettivi e guanti adatti. Utilizzare il reagente sotto cappa chimica

7 Frasi-R Frasi-S Sono chiamate frasi R alcune frasi convenzionali che descrivono i rischi per la salute umana, animale ed ambientale connessi alla manipolazione di sostanze chimiche Sono chiamate frasi S alcune frasi convenzionali che descrivono i consigli di prudenza cui attenersi in caso di manipolazione di sostanze chimiche Sono frasi codificate dall'Unione Europea nella direttiva 88/379/CEE.Unione Europea Ad ogni frase è associato un codice univoco composto dalla lettera R seguita da un numero. Ad ogni codice corrispondono le diverse traduzioni della frase in ogni lingua ufficiale dell'Unione Europea. È previsto dalle attuali normative che ogni confezione di prodotto chimico rechi sulla propria etichetta le frasi R e le frasi S corrispondenti al prodotto chimico ivi contenuto.etichettafrasi S

8 Bromuro di Etidio Evitare la contaminazione personale anche con luso di dispositivi di protezione personale (camice, guanti) I residui non devono essere dispersi nellambiente, ma sottoposti ad ossidazione, o assorbimento su resine o carbone attivo. Il responsabile del laboratorio deve scegliere una zona in cui potrà essere maneggiata tale sostanza La zona scelta dovrà essere segnalata in modo visibile. Tutte le operazioni che richiedono limpiego del bromuro di etidio dovranno essere effettuate entro larea evitando così contaminazioni di altre porzioni dellambiente lavorativo.

9 Accorgimenti Per la preparazione del gel di agarosio, qualora sia possibile, bisogna utilizzare materiale monouso: Sciogliere lagarosio in una beuta di vetro Versare il contenuto in un contenitore di plastica monouso Sotto cappa chimica: Aggiungere il Bromuro di Etidio utilizzando puntale con filtro, che, dopo lutilizzo deve essere gettato in contenitori appositi non perforabili presenti sotto cappa Fare attenzione a non sporcare la pipetta con il colorante durante questa operazione Richiudere il contenitore di plastica Gettarlo nellapposito contenitore per lo smaltimento dei rifiuti fornito dallAzienda Durante tutta la preparazione del gel controllare che i guanti siano puliti per evitare qualsiasi tipo di contaminazione

10 Alternativa al BrEt (1) Ove sia tecnicamente possibile e obbligatorio sostituire eventuali agenti cancerogeni in uso, con altre sostanze o prodotti non nocivi o meno nocivi Il blu di metilene rappresenta una alternativa al bromuro di etidio quando la concentrazione di acidi nucleici non è un fattore critico. L'unico vantaggio è rappresentato dalla scarsa tossicità della molecola utilizzata [Old e Primrose, 1994] R 22 : Nocivo in caso di ingestione A temperatura ambiente si presenta come un solido blu scuro quasi inodore

11 Alternativa al BrEt (2) SYBR Green II RNA Gel Stain:è un colorante intercalante che si lega al prodotto di PCR producendo un segnale molto intenso Il prodotto non è codificato conformemente alle direttive CEE/norme sulle sostanze pericolose perché non contiene componenti pericolosi –Sulla pelle: non ha effetti irritanti –Sugli occhi: non irritante –Sensibilizzazione: non si conoscono effetti sensibilizzanti Nella manipolazione osservare le misure di sicurezza usuali impiegate nellutilizzo di sostanze chimiche

12 Trizol Reagente utilizzato per le estrazioni di RNA da sangue in toto, da cellule e da tessuto Permette lestrazione contemporanea di DNA e di proteine dalla fase organica Soluzione monofasica di fenolo e guanidina isotiocianato Il prodotto è classificato ed etichettato secondo Direttiva 1999/45/CE Classificazione Indicazione di pericolo T Tossico Frasi R R34-Provoca ustioni R26/27/28-Molto tossico per inalazione, contatto con la pelle e per ingestione Utilizzare il reagente sotto cappa chimica

13 Cloroformio R22: Nocivo per ingestione R38: Irritante per la pelle R40: Possibilità di effetti cancerogeni- prove insufficienti (Direttiva2001/59/CE della commissione R48/20/22: Nocivo: pericolo di gravi danni alla salute in caso di esposizione prolungata per inalazione ed ingestione S(02): (conservare fuori della portata dei bambini) S36/37: Usare indumenti protettivi e guanti adatti Utilizzare il reagente sotto cappa chimica Stato fisico; Aspetto : Liquido incolore, con odore caratteristico

14 ß-mercaptoetanolo Utilizzo: Estrazione di RNA totale da cellule eucariotiche T+ Molto Tossico N Pericoloso per lambiente R22: Nocivo per ingestione R24: Tossico a contatto con la pelle R34: Provoca ustioni Forma: Liquido Colore: Incolore Odore: Forte Utilizzare il reagente sotto cappa chimica

15 ß-mercaptoetanolo ACCORGIMENTI Essendo molto pericoloso, in caso di contatto cutaneo (corrosivo, assorbito attraverso la pelle), utilizzarlo sempre indossando camice, guanti protettivi e verificare che durante i singoli passaggi non si verifichi contaminazione degli stessi. Utilizzare sempre puntali con filtro Al termine dellutilizzo, prima di chiudere la cappa chimica, verificare che il contenitore utilizzato per lo smaltimento dei rifiuti sia chiuso per evitare dispersione degli odori perché Il ß-mercaptoetanolo è molto pericoloso in caso di inalazione (corrosivo per i polmoni)

16 Guanidina tiocianato Nocivo Frasi-R R20/21/22: nocivo per inalazione, contatto con la pelle e per ingestione R32: a contatto con acidi libera gas altamente tossici R36/38: irritante per gli occhi e la pelle Frasi-S S14: conservare lontano da acidi (forti) S23: non respirare i vapori S36/37: usare indumenti protettivi e guanti adatti

17 Dimetilsulfossido Impieghi Preparazione della soluzione di congelamento per criopreservazione: –Linee cellulari –Sospensioni linfocitarie –CSEP –BM

18 Dimetilsulfossido Frasi di Rischio R36: Irritante per gli occhi R37: Irritante per le vie respiratorie R38: Irritante per la pelle Frasi di Sicurezza S23: non respirare i fumi S26: in caso di contatto con gli occhi, lavare immediatamente ed abbondantemente con acqua e consultare un medico S36/37: Indossare indumenti protettivi e guanti adatti Xi Irritante

19 Dimetilsulfossido Limite di esposizione personale Non è stato definito alcun limite di esposizione Dispositivi di protezione individuale Protezione respiratoria: nessuna raccomandazione specifica Protezione degli occhi: utilizzare gli occhiali di sicurezza Protezione delle mani: utilizzare guanti adatti Protezione della pelle: indossare indumenti protettivi adatti Misure da adottare in caso di versamento accidentale Precauzioni individuali: evitare il contatto con la pelle, gli occhi e gli indumenti Metodi di pulizia: raccogliere quanto possibile in un recipiente pulito per lo smaltimento. Sciacquare i residui con molta acqua

20 Diaminobenzidina (DAB) La morfologia è il principale criterio per la diagnosi di LAL e per la differenziazione dalle LAM Non sempre losservazione della morfologia delle cellule è sufficiente per inquadrare con esattezza lorigine linfoide o mieloide della leucemia perciò su di uno striscio di sangue midollare viene testata la reazione della PEROSSIDASI La PEROSSIDASI è un enzima che appartiene alla classe delle ossidoriduzioni, cioè catalizza lossidazione di un substrato rimuovendo due atomi di idrogeno che vengono a combinarsi con una molecola di acqua ossigenata. Nel nostro caso il substrato è la DIAMINOBENZIDINA

21 Reazione di ossidoriduzione Per azione della perossidasi contenuta nei lisosomi cellulari, la DAB si riduce formando un precipitato di colore giallo-bruno : Perossidasi + H 2 O H 2 O DAB (ossidato) DAB (ridotto) Risultano positive a questa reazione le cellule che, sul vetrino, assumono una pigmentazione granulare giallo-bruna e ciò accade per le cellule della linea promielocitaria e monocitaria. Quando queste cellule sono presenti con una percentuale < 3% si valuta la leucemia di origine linfocitaria

22 DAB Xn Nocivo Frasi-R R40: possibilità di effetti irreversibili Frasi-S S36/37: usare indumenti protettivi e guanti adatti Proprietà fisiche e chimiche Forma: Liquido Colore: Chiaro Odore: Inodore Detergente consigliato: acqua eventualmente con laggiunta di detersivi Manipolazione Indicazioni per una manipolazione sicura: Non sono richiesti provvedimenti particolari Stoccaggio 4°C Non conservare a contatto con ossidanti

23 DAB ACCORGIMENTI Utilizzare il reagente sotto cappa chimica Utilizzare pasteur monouso e puntali con filtro Versare lo scarto in contenitori appositi per lo smaltimento dei rifiuti tossici facendo attenzione a non inalare eventuali aerosol Lavare la vetreria con abbondante acqua e detersivi


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