Next topics…. LC-MS – Prof. Zattoni Orario data n° ore 11-12 12-11 1 Introduzione alla proteomica Approcci analitici all’analisi di macromolecole biologiche. Progetti “-omics” Obiettivi dell’indagine proteomica. Proteomica sistematica, funzionale, differenziale. 11-13 16-11 2 Spettrometria di massa per l’analisi di proteine Analizzatori di massa a quadrupolo, a tempo di volo, a trasformata di Fourier. Principi di doppia spettrometria di massa: modalità di acquisizione del segnale e modalità di scansione. Spettrometri di massa ibridi. Scelta della tecnica di ionizzazione e dell’analizzatore di massa. Considerazioni sulla risoluzione dello spettrometro: massa monoisotopica e massa media. 18-11 Approcci separativi multidimensionali Accoppiamento tra tecniche separative. Tecniche ortogonali, tecniche “in tandem”, “hyphenation”. Approcci all’analisi proteomica: Approcci top-down, bottom-up, shotgun. Frammentazione dei peptidi. Digestione enzimatica. Interpretazione dello spettro di massa di peptidi. 19-11 Strategie di indagine proteomica Approcci gel-based e gel-free. 2D PAGE MS/MS. 2D LC MS/MS. Sequenziamento “de novo” e identificazione da banca dati. 23-11 Accoppiamento della MS con tecniche separative multidimensionali per la proteomica. Approcci gel-based e gel-free. 2D PAGE MS/MS. 2D LC MS/MS. Sequenziamento “de novo” e identificazione da banca dati. Totale ore 8

Analisi di macromolecole biologiche Classi di macromolecole biologiche Proteine - Peptidi Acidi nucleici Polisaccaridi Lipidi Proprietà Alto/altissimo peso molecolare Proprietà chimico-fisiche eterogenee Campioni biologici estremamente complessi

Metodologie analitiche integrate Campione complesso (cellula, fluido biologico) Tecniche preparative e/o separative (rimozione di interferenti, separazione degli analiti) Tecniche di caratterizzazione (identificazione e quantificazione degli analiti)

Tecniche analitiche Tecniche separative HPLC, SEC, CZE, elettroforesi su gel. Approcci multidimensionali con tecniche ortogonali o “in tandem” Tecniche MS Sorgenti: a bassa frammentazione ESI, MALDI Analizzatori: adatti all’analisi di valori m/z elevati (TOF, quadrupolo (con ESI), FT ICR. Spettrometria di massa tandem con analizzatori ibridi

I progetti -OMICI Genoma Trascrittoma Proteoma Identificare tutta la serie di ordini che il codice genetico può impartire ad una cellula, per comprendere e prevenire situazioni patologiche Trascrittoma Identificare e quantificare tutta la serie di ordini che il genoma impartisce effettivamente alla cellula, per comprendere ed eventualmente correggere le modalità di regolazione genica Proteoma Caratterizzare e quantificare il contenuto proteico di un sistema cellulare, mediante la determinazione di profili di espressione differenziati nel tempo e nello spazio, comprensivi delle informazioni sulle interazioni molecolari

Ruolo della MS in proteomica Proteomica sistematica Identificazione e sequenziamento di tutte le proteine contenute in un tessuto. (analisi di miscele di peptidi e proteine intere) Proteomica strutturale (o differenziale) Studio delle differenze di espressione (qualitative o quantitative) rilevabili nel proteoma al variare delle condizioni del tessuto (es. cellula sana vs. cellula malata (determinazione di mutazioni nella sequenza, modifiche post-traduzionali, modifiche conformazionali, sovra o sottoespressione) Proteomica funzionale Studio della funzione biologica delle proteine e delle loro interazioni con proteine e peptidi (Separazione in condizioni non denaturanti e caratterizzazione allo stato nativo)

Proteomica sistematica Cellule, fluidi biologici Lisi, 2D-Gel Sequenziamento e identificazione (anche per confronto con il genoma)

Proteomica differenziale Cellule patogene, trattate, ecc… Cellule sane, non trattate, ecc… Lisi, 2D-Gel

Proteomica funzionale Interazioni Proteina-Peptide Variazione del peso molecolare Legame covalente irreversibile Legame covalente reversibile Nessuna variazione del peso molecolare Variazioni della conformazione Nessuna interazione Interazioni non covalenti

Schema di uno spettrometro di massa Computer Segnale Sistema di introduzione Sorgente di ioni Analizzatore di massa Rivelatore Campione Ioni Ioni 10-5-10-8 torr Campione Sistema di vuoto

Criteri per la scelta della sorgente Caratteristiche del campione Stato di aggregazione: solido, liquido. Metodo di introduzione: in flusso/discontinuo. Dimensione del campione Concentrazione dell’analita nel campione Caratteristiche dell’analita Peso molecolare Complessità della molecola Polarità (ionizzabilità)

Sorgenti ioniche a pressione atmosferica Stato del campione Sorgente a flusso Liquido Elettrospray (ESI) – nanospray APCI (atmospheric pressure chemical ionization) APPI (atmospheric pressure photoionization) LC: flussi ~ 0.1 – 1 cm3 min-1. Se l’eluente è acqua, 0.1 cm3 min-1 = 5.6 mmol min-1 = 135 cm3 min-1 (c.n.) Nano-HPLC: flussi ~ 10-4 cm3 min-1  0.1 cm3 min (c.n.)

Classificazione delle sorgenti ioniche Sorgenti “dure” (elevata frammentazione) Ionizzazione elettronica Sorgenti “molli” (bassa frammentazione) Fotoionizzazione (APPI) Ionizzazione chimica (APCI) Desorbimento (ESI, MALDI)

Applicabilità delle sorgenti a pressione atmosferica

ESI vs APCI - Sensibilità zona di applicabilità ideale Sensibilità relativa Flusso (µL/min) La ESI è sensibile alla concentrazione dell’analita, la APCI alla sua quantità assoluta. Per questo la ESI si presta ad essere accoppiata alla micro e nano HPLC per applicazioni in cui il campione sia disponibile in quantità molto ridotte.

Meccanismo fisico dell’elettrospray L’applicazione di un potenziale elettrico ad alto voltaggio ad una goccia di liquido ne provoca la frammentazione in goccioline fini. La causa e’ la repulsione elettrostatica tra le cariche che si generano nella goccia.

Sistema di nebulizzazione elettrospray Cono di Taylor Punta dell’ago

Sistema di desolvatazione per elettrospray Gas di trasporto Gocce di circa 1 µm Gas di desolvatazione Liquido di trasporto Campione Cono di Taylor Capillare riscaldato + - 2-6 kV

Meccanismo di deplezione degli ioni Soluzione del campione 4000 V Pressione atmosferica Calore o gas secco Il calore e/o il gas secco causano la riduzione delle dimensioni delle gocce Vapori del solvente Spettrometro di massa Livelli successivi di vuoto (2 torr – 0.1 torr – 0.01 torr) Esplosione Coulombiana Limite di Rayleigh: Limite di dimensioni della al quale si prevede la frammentazione della goccia. q2 = 8π2ε0γd3 q = carica totale della goccia ε0 = permittività elettrica del mezzo γ = tensione superficiale della goccia d = diametro della goccia

L’elettrospray genera spettri multicarica m/z La carica degli ioni è dovuta agli ioni metallici (es Na+) o ai protoni associati alla molecola. Gli addotti carichi sono quindi della forma: (M + H)+, (M + 2H)2+, …, (M + nH)n+

MALDI: vantaggi e limitazioni Sorgente a flusso sensibile alla concentrazione, ideale per l’accoppiamento online con tecniche separative miniaturizzate e per l’analisi quantitativa Ionizzazione soft (nessuna frammentazione) di molecole polari ad alto peso molecolare. Produce spettri multicarica La ionizzazione è un processo competitivo, per cui la simultanea presenza di più analiti o di sali può dare luogo ad interferenze. La complessità degli spettri multicarica limita l’interpretazione degli spettri ottenuti da miscele complesse

Sorgenti ioniche a desorbimento Desorbimento/ionizzazione laser assistiti da matrice (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization, MALDI) L’analita viene codepositato su un bersaglio con una matrice, scelta per favorire la vaporizzazione dell’analita. Caratteristiche della matrice: Elevata assorbività alla lunghezza d’onda del laser. Massa molare abbastanza bassa da sublimare facilmente. Bassa reattività chimica. Stabilità al vuoto. Le matrici più utilizzate sono acidi aromatici

Il processo MALDI Il bersaglio viene colpito da un impulso laser che viene assorbito dalla matrice e provoca la formazione di un plasma contenente gli atomi dell’analita ed atomi e ioni della matrice.

MALDI-TOF MS Range di massa fino a 106  Analizzatore a tempo di volo.

Spettro di massa del batterio intero Escherichia coli Lo spettro di massa Spettro di massa di ioni monocarica (MALDI/TOFMS) Intensità relativa m/z Spettro di massa del batterio intero Escherichia coli

MALDI: vantaggi e limitazioni Poco sensibile alle contaminazioni (sali, tamponi, detergenti ecc.) Solitamente non richiede complessi passaggi di purificazione del campione. Può analizzare velocemente miscele complesse di analiti (lo spettro è facile da interpretare) Non è una sorgente a flusso La ionizzazione è un processo competitivo, per cui la simultanea presenza di più analiti può dare luogo ad interferenze. L’analisi quantitativa è limitata dalla ridotta omogeneità del campione.

Schema di uno spettrometro di massa Computer Segnale Sistema di introduzione Sorgente di ioni Analizzatore di massa Rivelatore Campione (gassoso) Ioni Ioni 10-5-10-8 torr Campione Sistema di vuoto

Risoluzione La capacità di uno spettrometro di massa di differenziare le masse è generalmente espressa dalla risoluzione R definita come: R = m/Δm dove Δm è la differenza di massa tra due picchi adiacenti risolti e m è la massa nominale del primo picco (o la media delle masse dei due picchi). Due picchi sono considerati separati se l’altezza della valle tra di essi è inferiore ad una certa percentuale della loro altezza (di solito il 10%). Uno spettrometro con una risoluzione di 4 000 risolverà due picchi con valori di m/z 400,0 e 400,1 (o di 40,00 e 40,01). Gli spettrometri commerciali hanno R che variano circa tra 500 e 500 000.

Definizione alternativa Risoluzione Picchi risolti al 10% della valle Picchi risolti al 80% della valle Intensità Definizione alternativa La risoluzione di un picco isolato si può anche definire come larghezza δm del picco al x% dell’altezza. Spesso si prende x = 50%, e δm è la larghezza a metà altezza.

Classi di analizzatori di massa A settore magnetico A doppia focalizzazione A quadrupolo lineare (Q) Trappola ionica a quadrupolo (QIT) A tempo di volo (TOF) A risonanza ciclotronica e trasformata di Fourier (FT-ICR)

Analizzatore di massa a quadrupolo Potenziale nel quadrupolo

Traiettorie dello ione piano xz Traiettoria instabile lungo x, stabile lungo y piano yz piano xz piano yz Traiettoria stabile sia lungo x che lungo y

Traiettorie ioniche nella trappola a quadrupolo Moto degli ioni in direzione z Moto degli ioni in direzione r tempo Gli ioni vengono intrappolati forzandoli su traiettorie chiuse stabili all’interno della trappola. Quando la traiettoria di uno ione diventa instabile, questo esce dalla trappola e viene rivelato.

Analizzatore di massa a quadrupolo Massimo valore m/z ~ 4 000 (applicabile alla MS di proteine solo in accoppiamento con la ESI) Risoluzione ~ 3 000 I quadrupoli sono strumenti a bassa risoluzione Si lavora normalmente alla risoluzione di una unità di massa. Leggero, di dimensioni contenute Facile da accoppiare alla cromatografia Efficiente trasmissione degli ioni Necessaria una elevata precisione nell’allineamento delle barre degli elettrodi

Analizzatore a tempo di volo (TOF) Zona di accelerazione con campo elettrostatico E Ioni positivi Sorgente d V = 0 dE = V0 = 20 000 V V = V0 L

Reflectron TOF a stadio singolo Metodo per correggere la distribuzione di velocità, diminuendo Δt Sorgente Reflectron TOF a stadio singolo

Analizzatore di massa a tempo di volo Massimo valore m/z > 200 000 Risoluzione fino a 105. Il reflectron consente di: Ridurre le dimensioni Aumentare la risoluzione Ideale accoppiamento con sorgenti pulsate (ma adattabile anche a sorgenti continue) Efficiente trasmissione degli ioni

Principi della ICRFT MS Gli ioni in un campo elettromagnetico si muovono su traiettorie circolari (o a spirale), generando esse stesse una radiazione elettromagnetica, la cui frequenza dipende dal rapporto m/z dello ione. Tale r.e.m. può essere rivelata da un’antenna, generando un segnale che contiene le radiofrequenze di tutti gli ioni in funzione del tempo. Mediante trasformata di Fourier il segnale viene passato dal dominio del tempo al dominio delle frequenze, e di conseguenza al dominio delle masse (o meglio di m/z).

Analizzatore a risonanza ciclotronica Piano di ricezione Piano di emissione

Analisi di massa a trasformata di Fourier Segnale nel dominio del tempo Segnale trasformato nel dominio delle frequenze  m/z

Analizzatore di massa a ICR FT Massimo valore m/z > 50 000 Risoluzione fino a 106. Possibilità di intrappolare gli ioni. Massima accuratezza nella determinazione delle masse. Semplicità nel passaggio da ioni positivi a ioni negativi. Prezzi ancora proibitivi per molte applicazioni (500 –1 400 k€)

Separazioni multidimensionali 2D-PAGE: separazione bidimensionale ortogonale IEF + SDS PAGE Il risultato è evidentemente una separazione bidimensionale. I due processi separativi si sviluppano ortogonalmente Domande: - Tutti gli accoppiamenti fra tecniche separative danno origine a separazioni multidimensionali? - Come si definisce l’ortogonalità di due tecniche separative?

Separazioni multidimensionali Tecniche correlate e non correlate Tecniche “ortogonali” Tecniche correlate

Separazioni multidimensionali Accoppiamento di due colonne LC basate su principi diversi a b c+d a+b c d Accoppiamento “in tandem” 1) Il risultato che si ottiene è un cromatogramma monodimensionale 2) La separazione ottenuta nella prima colonna può essere distrutta nella seconda.  Non è una separazione bidimensionale

Separazioni multidimensionali Per realizzare l’accoppiamento bidimensionale fra due colonne cromatografiche (o altre tecniche separative a flusso) è necessario un dispositivo che isoli le frazioni ottenute in prima separazione, in modo che non possano mescolarsi durante la seconda separazione. Il risultato è una mappa cromatografica bidimensionale

Separazioni multidimensionali Definizioni classiche (Giddings) Una separazione si definisce multidimensionale se soddisfa le seguenti due condizioni: Il meccanismo di separazione di ciascun passaggio deve essere “ortogonale” agli altri. La separazione ottenuta in ciascun passaggio non deve essere perduta nei passaggi successivi.

Separazioni multidimensionali Multidimensionalità e tecniche accoppiate Il concetto di multidimensionalità è estendibile alla combinazione fra tecniche separative e tecniche di rivelazione. Convenzionalmente si definiscono: Coupling (accoppiamento): combinazione tra più tecniche separative (es. LC-GC) Hyphenation (ifenazione): combinazione tra una tecnica separativa e un rivelatore o tecnica di caratterizzazione (es. GC-MS, LC-UV)

Separazioni multidimensionali FFF-FL: tecniche ifenate ortogonali ex 325 nm Void (463 nm) NPs (525 nm) Elution Time (min) em (nm) FFF e fluorescenza sono ortogonali perché la separazione avviene in base a proprietà dimensionali, non correlate alle proprietà spettroscopiche

Separazioni multidimensionali FFF-MS: tecniche ifenate correlate Dai valori di tr in FFF Una deviazione dalla correlazione evidenzia una variazione confromazionale Dai valori di m/z in MS

Separazioni multidimensionali Definizione generale di multidimensionalità Si definisce multidimensionale la combinazione di tecniche il cui risultato sia la “dislocazione” dell’informazione rispetto a più di una variabile. Il segnale analitico può essere rappresentato come una funzione di almeno due variabili di dislocazione. Dislocazione tempo volume λ distanza m/z potenziale massa

Doppia spettrometria di massa (MS/MS) Ionizzazione e frammentazione analisi di massa m/z decomposizione m1

Applicazioni della MS/MS Maggior contenuto di informazioni Studio della struttura Informazioni addizionali per determinare la struttura di uno ione Rivelazione selettiva di uno ione Drastica riduzione delle interferenze Studio delle reazioni ione-molecola

MS/MS nello spazio e nel tempo Cella di collisione MS/MS nello spazio MS/MS nel tempo Tempo 1 Tempo 2 Tempo 3 Scansione dello ione prodotto Selezione m/z Scansione

Combinazioni strumentali per MS/MS MS/MS nello spazio Settori elettrico-magnetico: EB/EB o BE/BE (max MS4). Triplo quadrupolo: QqQ Tempo di volo lineare/reflectron: TOF/TOF. Analizzatori ibridi: EBqQ QqTOF MS/MS nel tempo (MSn) Trappola ionica a quadrupolo (max MS8) Risonanza ciclotronica (ICR FTMS) Combinati: Qq(trap) MSn nello spazio e/o nel tempo

Modalità di scansione MS/MS Scansione dello ione prodotto Selezione m/z Scansione Scansione dello ione precursore Simbolismo alternativo Analizzatore di massa fisso Spettrometro di massa a scansione Scansione dello ione prodotto Scansione dello ione precursore Scansione di perdita neutra Monitoraggio di reazione selezionata Scansione Selezione m/z Scansione di perdita neutra Scansione m/z = x Scansione m/z = x-a Monitoraggio di reazione selezionata Selezione del precursore m/z = a Selezione del frammento m/z = b

Modalità di scansione MS/MS Scansione dello ione prodotto: consiste nel selezionare uno ione precursore, di m/z fissato, e nella determinazione di tutti gli ioni prodotti dalla frammentazione attivata per collisione (CID). Se nella cella di collisione si usa un gas reagente, si osservano i prodotti di reazione attivate per collisione (CAR). Quando vengono prodotti solo ioni frammento, questa modalità di scansione è detta anche scansione di ioni frammento. Scansione dello ione precursore: consiste nello scegliere uno ione prodotto e nel determinare gli ioni precursori. Permette di identificare gli ioni precursori di un certo frammento. Questa modalità di scansione, che non si può realizzare con la in time MS/MS, richiede la focalizzazione del secondo analizzatore su di uno ione selezionato, e la scansione di massa sul primo analizzatore. Vengono rivelati gli ioni precursori che per reazione o frammentazione producono ioni figlio della massa selezionata.

Modalità di scansione MS/MS Scansione di perdita neutra (NLS): consiste nello scegliere un frammento neutro e nel rivelare tutte le frammentazioni che portano alla perdita di tale frammento. Come nel caso della scansione dello ione precursore, questa modalità non è realizzabile in MS/MS nel tempo. La scansione richiede che entrambi gli analizzatori scandiscano contemporaneamente, ma con una differenza di massa fissa a fra di loro. Quando uno ione di massa m attraversa il primo analizzatore, viene rivelato solo se produce un frammento di massa m – a. Monitoraggio di reazioni selezionate (SRM): consiste nel selezionare una reazione di frammentazione. In questa modalità, entrambi gli analizzatori sono focalizzati su masse selezionate. Non si ha quindi scansione. È analogo al “monitoraggio di ioni selezionati” in spettrometria di massa singola, ma in questo caso gli ioni selezionati dal primo analizzatore danno un segnale solo se producono un certo frammento mediante una certa reazione. L’assenza di scansione permette di aumentare la sensibilità, oltre che la selettività.

Combinazioni strumentali per MS/MS MS/MS con risoluzione nello spazio Settori elettrico-magnetico: EB/EB o BE/BE (max MS4). Triplo quadrupolo: QqQ Tempo di volo lineare/reflectron: TOF/TOF. Combinati: EBqQ QqTOF MS/MS con risoluzione nel tempo (MSn) Trappola ionica a quadrupolo (max MS8) Risonanza ciclotronica (ICR FTMS) Combinati: Qq(trap) MSn nello spazio e/o nel tempo

Scelta dell’analizzatore

Massa monoisotopica e massa chimica Massa monoisotopica (picco 12C): 1085.55 Massa media (picco 12C): 1086.28 Per peptidi e proteine la differenza fra massa media (chimica) e massa mono-isotopica è circa 0.06%, distinguibile se lo spettrometro ha risoluzione pari a: R = 100/0.06 = 1667 (nell’esempio sopra, R = 5000)

Identificazione del picco 12C Insulina Albumina bovina Per piccoli peptidi il primo picco, relativo alla massa monoisotopica, è anche quello più intenso. Questo non è vero per proteine di massa maggiore, in cui il picco 12C può essere poco intenso o addirittura non rivelabile. Oltre un certo valore di massa, il dato analitico utile è la massa media, che si ricava dal centroide del picco.

Risoluzione e sensibilità Quando non è possibile raggiungere risoluzione unitaria, ed identificare il picco di massa monoisotopica, è poco conveniente superare la risoluzione alla quale si può determinare la massa media con accuratezza. Questo è vero in particolare quando si deve raggiungere un compromesso fra risoluzione e sensibilità

Strategie proteomiche basate sulla MS Proteina (sconosciuta) 2D SDS PAGE bottom-up Top-down digestione Miscela di peptidi Massa dei peptidi mediante LC/LC/ESIMS shotgun Ricerca dei pesi molecolari in banca dati Massa di proteine intere mediante (LC)ESI/MS sconosciuta nota Sequenziamento in MSn sconosciuta MSn per ulteriori Informazioni sulla sequenza Identificazione e caratterizzazione di proteine nota Ricerca dei pesi molecolari in banca dati

Approccio proteomico top-down Si basa sulla determinazione della massa accurata (media) delle proteine in una matrice di complessità ridotta (ottenuta per purificazione con metodi biochimici o per separazione con tecniche non denaturanti) Permette di determinare la conformazione delle proteine nel loro stato nativo, e le interazioni proteina-proteina (complessi proteici fra biomarker e proteine di trasporto, oligomeri funzionali) Permette di determinare la composizione amminoacidica della proteina, ma non la loro sequenza Non identifica la proteina in modo univoco in un proteoma complesso Permette di studiare isoforme (mutazioni di singoli amminoacidi) e modificazioni post-traduzionali, ma non di localizzarle.

Approccio proteomico top-down Spettro m/z in ESI/qTOF di perossidasi di rafano (HRP) allo stato nativo Il software dello spettrometro di massa identifica le famiglie di picchi negli spettri multicarica sovrapposti, ne determina il valore di m/z medio (il centroide del picco) e calcola lo spettro di massa ricostruito

Approccio proteomico top-down 41521.9 B 41600.4 C 42343.1 D 42422.0 E 43165.0 F 43243.0 2Ca2+ Glicosilazione Sullo spettro di massa ricostruito si possono identificare isoforme, complessi metallo-proteina e modificazioni post-traduzionali

Masse degli aminoacidi Aminoacido Codice (3 lettere) Codice (1 lettera) Massa monoisotopica Massa chimica Glicina Gly G 57.02147 57.052 Alanina Ala A 71.03712 71.079 Serina Ser S 87.03203 87.078 Prolina Pro P 97.05277 97.117 Valina Val V 99.06842 99.133 Treonina Thr T 101.04768 101.105 Cisteina Cys C 103.00919 103.144 Isoleucina Ile I 113.08407 113.160 Leucina Leu L Asparagina Asn N 114.04293 114.104 Aspartato Asp D 115.02695 115.089 Glutammina Gln Q 128.05858 128.131 Lisina Lys K 128.09497 128.174 Gluatammato Glu E 129.04260 129.116 Metionina Met M 131.04049 131.198 Istidina His H 137.05891 137.142 Fenilalanina Phe F 147.06842 147.177 Arginina Arg R 156.10112 156.188 Tirosina Tyr Y 163.06333 163.170 Triptofano Try W 186.07932 186.213

Frammentazione dei peptidi x3 y3 z3 x2 y2 z2 x1 y1 z1 R1 R2 R3 R4 O O O O H2N-CH C NH CH C NH CH C NH CH-COH a1 b1 c1 a2 b2 c2 a3 b3 c3 R4 R1 R2 + + R3 O O O O C NH CH C NH3 CH C NH CH-COH H2N-CH b2 y”2

LC-MS/MS per l’identificazione “de novo” della sequenza peptidica m/z 600 200 1000 y2 b3 y3 y4 y5 b7 y7 b8 y6 b9 y9 y10 b11 b12 MS/MS MS trace MS/MS trace 30 40 50 Time [min]

Interpretazione dello spettro di massa di peptidi

+ H R-C N-R’ O H R-C-OH H N-R’ O Digestione enzimatica proteina legame peptidico H R-C N-R’ *alcuni enzimi proteolitici specifici sono: tripsina tagli specifici solo a Lys-X o Arg-X Lys-C Lys-X Arg-C Arg-X Glu-C (V-8) Glu-X and Asp-X O Enzima * proteolitico H2O H + (frammenti proteolitici) R-C-OH H N-R’ O

Identificazione di siti modificati Peso Molecolare Proteina Intatta Coincide con valore atteso? No Sì Proteina sbagliata Mutazione Modifica post-traduz. Peptide Mapping Peptide/i modificato/i MS/MS Identificazione Sito/i modificato/i

Modifiche post-traduzionali Glicosilazione Variabile (153.21->3000 Da) Fosforilazione +79.98 Da Acetilazione +42.04 Da Formilazione +28.26 Da Ossidazione +16.01 Da Riduz. ponti disolfurici +2.02 Da Ancora glicolipidica Variabile

Proteomica bottom-up Approccio 2D PAGE – MALDI TOFMS Elettroforesi bidimensionale (2D PAGE) 1000 1500 2000 Mass (m/z) estrazione dei peptidi analisi MALDI/TOFMS taglio degli spot; digestione con tripsina identificazione della proteina

Identificazione di peptidi in banca dati È la più comune procedura per l’identificazione dei peptidi mediante spettrometria di massa La lista dei pesi molecolari ottenuta dall’analisi MALDI/TOFMS viene inserita in banca dati per l’identificazione della proteina incognita. Solitamente i segnali dei picchi a basso peso molecolare (< 500 Da) vengono esclusi dalla ricerca in quanto potrebbero essere segnali di matrice.

Digestione automatizzata: MALDI prep Procedura di identificazione automatizzata Digestione automatizzata: MALDI prep Spot Cutter 2D GEL MALDI/TOF MS Risultati elaborazione dei dati e ricerca in banca dati

Vantaggi e limiti dell’elettroforesi L’elettroforesi bidimensionale è oggi la più potente tecnica separativa utilizzata per le proteine, tuttavia essa presenta una serie di svantaggi: E’ ristretta a proteine in un intervallo di masse molecolari tra 104 e 106 Da Non è possibile rivelare proteine poco espresse (bassa sensibilità) Bassa riproducibilità da gel a gel Lo spettrometro di massa non può essere interfacciato on-line con la tecnica separativa.

Una alternativa alla 2D PAGE Cromatografia bidimensionale Una alternativa alla 2D PAGE Due (o più) tecniche “ortogonali” vengono combinate per migliorare la separazione fra i peptidi e facilitarne l’identificazione Separazioni cromatografiche 1000 1500 2000 Mass (m/z) (*) Identificazione de novo o in banca dati Analisi di massa (*) La digestione proteolitica può avvenire prima della separazione (approccio shotgun) o dopo la separazione delle proteine intere (approccio bottom-up gel-free)

LC/LC MSn per l’analisi di miscele di peptidi frazione 1 frazione 2 minuti prima dimensione: cromatografia a scambio ionico diverse frazioni di peptidi vengono eluite effettuando un gradiente di tampone salino a valori crescenti di forza ionica.

LC/LC MSn per l’analisi di miscele di peptidi Seconda dimensione: cromatografia a fase inversa (C4 – C18) Ciascuna frazione contenente i peptidi eluiti dalla colonna a scambio ionico viene ulteriormente separata su una colonna cromatografica a fase inversa e i singoli peptidi sono rivelati e identificati utilizzando uno spettrometro di massa ESI-Q/TOF in modalità MS/MS

Ottica di trasferimento Esapolo (cella di collisione) ESI-QqTOF MS/MS Cono di campionamento Ottica di trasferimento Quadrupolo Esapolo (cella di collisione) Nel quadrupolo vengono rilevate e selezionate le masse dei peptidi, che sono poi frammentati nell’esapolo. La massa accurata dei frammenti è determinata nel tubo di volo.

LC/LC MSn per l’analisi di miscele di peptidi

Proteomica differenziale quantitativa ISOTOPE-CODED AFFINITY TAG (ICAT) Si marcano le proteine nei due campioni da confrontare con reagenti “pesanti” o “leggeri” Gruppo chimicamente reattivo: si lega covalentemente a proteine e peptidi Isotope-labeled linker: pesante o leggero, a seconda dell’isotopo usato Affinity tag: permette la separazione della proteina o del peptide marcato mediante cromatografia di affinità

Esempio di un reagente ICAT Biotin Affinity tag: Si lega fortemente e selettivamente a una resina di agarosio-streptavidina Gruppo reattivo: gruppo tiolico in grado di legarsi alle cisteine Linker: La versione pesante è deuterata in *

Isolamento per affinità su streptavidina Come funziona l’ICAT? Isolamento per affinità su streptavidina Lisi e marcatura Quantificazione MS Identificazione MS/MS NH2-EACDPLR-COOH Leggero 100 200 400 600 100 550 570 590 MIX Pesante Proteolisi (eg tripsina) m/z m/z

ICAT: Pro e contro Stima le concentrazioni relative di proteine fra due campioni con un livello di accuratezza ragionevole (> 10%) Si può usare in miscele di proteine complesse La marcatura Cys-specifica reduce la complessità del campione È possibile sequenziare direttamente i peptidi in MS/MS Frammentazione del marcatore (problemi di resa e specificità) Leggere differenze cromatografiche fra gli isotopi Costoso Difficile interpretazione del risultato analitico Impossibile quantificare peptidi senza Cys o con Cys inaccessibili stericamente

Imaging MALDI Immagine molecolare di una sezione di tessuto Abbondanza e distribuzione di proteine e altre specie

Imaging MALDI Considerazioni metodologiche La dissezione deve preservare la localizzazione degli analiti La matrice deve essere applicata omogeneamente in senso geometrico (superficie piatta) e chimico. Si utilizzano metodi automatizzati. La sezione del raggio laser è il limite della risoluzione in modalità raster. Le informazioni quantitative sono essenzialmente relative (fra zone diverse di tessuto). Si possono usare standard interni per una quantificazione semi-assoluta. L’impiego di un MALDI TOF/TOF o di QqTOF in modalità MS/MS permette il sequenziamento delle proteine.

Whole body MALDI imaging: tomografia distruttiva. Imaging MALDI Whole body MALDI imaging: tomografia distruttiva. Eticamente accettabile?