PREPARATIVA per separare: CENTRIFUGAZIONE SEPARAZIONE di sostanze basata sul differente comportamento di particelle (o molecole) in CAMPO GRAVITAZIONALE PREPARATIVA per separare: cellule frazioni subcellulari organelli, virus, membrane macromolecole SI PARTE da grandi quantità di materiale ANALITICA studio delle caratteristiche di SEDIMENTAZIONE di molecole o particelle PURE MONITORAGGIO- - > equip. speciale SI UTILIZZANO piccole quantità di materiale da analizzare

Campo gravitazionale artificiale Fc = m2r

Fc = m2r Fg = mg Fg = Forza di gravità m = massa (peso della particella in grammi) 2 = velocità angolare del rotore (rad/sec) r = distanza dall’asse di rotazione (cm) Fg = mg Fg = Forza di gravità g = accellerazione della forza di gravità pari a 980 cm x sec-2

RCF (Relative Centrifugal Field) Forza Centrifuga Relativa RCF = Fc/Fg = m2 r = 2 r mg g  = numero di giri al minuto RCF = 4 p (rpm)2 x r = 1.118 x 10-5 x rpm2 x r 3600 x 980 RCF rapporto tra peso di una particella sottoposta ad un campo centrifugo ed il peso della stessa soggetta al solo campo centrifugo gravitazionale

Fc = m2r

RCF (Relative Centrifugal Field) Forza Centrifuga Relativa RCF: rapporto tra peso di una particella sottoposta ad un campo centrifugo ed il peso della stessa soggetta al solo campo centrifugo gravitazionale

raggio RCF x g Velocità rotore rpm

Tipi di rotori a braccio oscillante ad angolo fisso

ROTORI A BRACCIO OSCILLANTE: a riposo è in posizione verticale durante la centrifugazione il campione si dispone in posizione perpendicolare all’asse di rotazione e parallela al campo centrifugo applicato; durante la decelerazione, il campione ritorna nella posizione originaria.

AD ANGOLO FISSO tubi ospitati in alloggiamenti inclinati secondo un angolo fisso, da 15° a 40° sotto l’influenza del campo centrifugo le particelle si muovono in senso radiale, incontrano la parte della provetta e precipitano su di essa formando un sedimento piccolo e compatto - cammino delle particelle breve - sedimentazione rapida

CENTRIFUGHE DA BANCO 4000 - 15000 rpm (RCF fino a 10000 x g) Possono alloggiare sia rotori ad angolo fisso che a braccio oscillante. utili per centrifugare volumi relativamente piccoli (frazioni di ml --> 50 ml) si utilizzano generalmente per isolare rapidamente materiali che sedimentano velocemente (cellule, nuclei, ac.nucleici o proteine, etc.) possono essere refrigerate o a temperatura ambiente

CENTRIFUGHE DI GRANDE CAPACITA' sono sempre refrigerate capacità da pochi ml a oltre a 2 litri fino a 8000 rpm (10000 x g) fino a 25000 rpm (60000 g) - sedimentazione di cellule, batteri, frazioni subcellulari di grandi dimensioni, acidi nucleici, proteine - rotori ad angolo fisso o a braccio oscillante -BILANCIAMENTO

ULTRACENTRIFUGA PREPARATIVA - volumi fino a 200-300 ml - Vel. Max 80000 rpm (RCF fino a 600000 g) - Refrigerate, con camera del rotore sigillata e sotto vuoto - controllo della temperatura, velocità e del bilanciamento - camera del rotore corazzata - sedimentazione di acidi nucleici, proteine, piccoli organelli (es: ribosomi)

La sedimentazione di una particella in soluzione, soggetta ad un campo centrifugo DIPENDE: Dal campo centrifugo applicato Dalla sua densità (massa e volume) Dalla densità e/o viscosità del mezzo Dalla forma della particella Dalla distanza tra la particella e l’asse di rotazione tempo di centrifugazione PARTICELLE CON MASSA DIVERSA sottoposte allo stesso campo centrifugo sedimentano a velocità diversa

CENTRIFUGAZIONE DIFFERENZIALE Basata sulla differente velocità di sedimentazione di particelle dotate di diverse dimensioni e densità Se particelle diverse hanno stessa massa ma diversa densità, quelle a densità maggiore sedimentano più velocemente. Le particelle vengono separate mediante varie tappe di centrifugazione aumentando di volta in volta il campo centrifugo applicato (RCF) in modo da ottenere in ogni tappa un SEDIMENTO contenente uno specifico tipo di particelle, ed un SOPRANATANTE contenente tutte le particelle non sedimentate

CENTRIFUGAZIONE DIFFERENZIALE

L’analisi della sedimentazione di una particella in Sospensione può essere utilizzata per studiarne le sue proprietà

Le dimensioni di una particella hanno la maggior influenza sulla velocità di sedimentazione; Particelle di dimensioni diverse = tempi di sedimentazione diversi Una miscela di particelle eterogenee e approssimativamente sferiche possono essere separate mediante centrifugazione sulla base della loro dimensione (o densità) in termini di: * tempo necessario per la loro sedimentazione completa * entità della sedimentazione in un definito periodo di tempo

La velocità di sedimentazione di una particella può essere espressa in termini di coefficiente di sedimentazione (s) che corrisponde alla velocità di sedimentazione per unità di campo centrifugo applicato Il coefficiente di sedimentazione ha le dimensioni di un tempo e si misura in Svedberg, S. 1 S = 10-13 sec Esempio: s = 5 x 10-13 sec corrisponde a 5S Specie sedimentate Coeff. di sedimentazione Enzimi, ormoni e proteine 2 – 25S Acidi nucleici 3 – 100S Ribosomi, polisomi 20 - 200S Virus 40 – 1000S Lisosomi 4000S Membrane 100 – 100000S Mitocondri 20000 – 70000S

CENTRIFUGAZIONE IN GRADIENTE DI DENSITA’ Sfrutta differenze di: dimensioni forma densità

GRADIENTE DI DENSITA’ CARATTERISTICHE Materiali con buona solubilità Poco costoso, Non tossico, non deve interagire con le particelle da separare Materiali Puri SOSTANZE USATE Sali di minerali pesanti CsCl Piccole molecole organiche Saccarosio Polimeri sintetici Ficoll Silice colloidale Percoll

Gradiente discontinuo Dispositivi per la preparazione di un gradiente Gradiente lineare Gradiente discontinuo

CENTRIFUGAZIONE ZONALE separazione di particelle con densità simile ma massa (e quindi dimensioni) diversa. Formazione di un gradiente continuo di densità 2) stratificazione del campione sul gradiente di SACCAROSIO 3) centrifugazione per un tempo sufficiente alla sedimentazione delle particelle in ZONE discrete, ma NON sufficiente per la sedimentazione al fondo della provetta 4) raccolta di frazioni per l’analisi Usata per la separazione di organelli, proteine, ibridi RNA –DNA, subunità ribosomali etc.

CENTRIFUGAZIONE ISOPICNICA o ALL’EQUILIBRIO Separa le particelle di una miscela esclusivamente in base alla DENSITA’, e NON in base alla forma ed alle dimensioni. E’ INDIPENDENTE dal tempo di centrifugazione. Il gradiente di densità può essere continuo o discontinuo (viene allestito utilizzando una soluzione la cui densità massima DEVE essere superiore a quella di tutte le particelle da separare) - Stratificazione del campione nel caso di gradienti discontinui

- CENTRIFUGAZIONE ALL’EQUILIBRIO (cioè, per un tempo sufficiente affinché TUTTE le particelle raggiungano una regione del gradiente dove la loro densità corrisponde a quella presente in quella zona del gradiente) - raccolta delle frazioni per l’analisi; USATA PER LA SEPARAZIONE DI POPOLAZIONI CELLULARI, FRAZIONI SUBCELLULARI DI SIMILI DIMENSIONI ETC.

Separazione di DNA plasmidico da quello del cromosoma batterico Mediante centrifugazione all’equilibrio in gradiente di Cloruro di Cesio

Un esempio di applicazione della centrifugazione in GRADIENTE DI DENSITA’