Polymerase chain reaction amplification of the Bag320 satellite family reveals the ancestral library and past gene conversion events in Bacillus rossius (Insecta Phasmatodea) M. Cesari, A. Lucchetti, M. Passamonti, V. Scali, B. Mantovani; 2003 Carla Busatto

INTRODUZIONE Il DNA satellite è formato da sequenze simili ma non uguali ripetute in tandem (una dopo l’altra), principalmente collocato nei centromeri e nei telomeri dei cromosomi. Attualmente si pensa che queste sequenze siano coinvolte in molti processi e/o funzioni (struttura dei centromeri e dinamica, evoluzione dei cariotipi, trascrizioni tessuto-specifiche e sesso-specifiche). Il DNA satellite tende ad essere più omogeneo all’interno di un’unità evolutiva (cromosoma, popolazione, sottospecie, specie…) che non tra unità evolutive diverse.

Il DNA satellite è un esempio di evoluzione concertata ed è archiviato nell’unità evolutiva tramite la trasmissione molecolare che coinvolge: L’omogenizzazione di nuove varianti in tutta la famiglia ripetuta per mezzo di meccanismi di turnover genomici, La loro fissazione nella popolazione come conseguenza della riproduzione sessuale. Le famiglie di DNA satellite, nelle specie di Insetti presentano una variabilità tra monomeri che va dall’1 al 15%. Molte famiglie possono essere specie-specifiche qualitativamente o avere un numero di copie specie- specifico.

IPOTESI LIBRARY: I taxa affini vanno a formare una library contenente varianti di sequenze monomeriche satellite che possono essere diversamente amplificate come numero di copie. Questa non predice i meccanismi e non può valutare se c’è una pressione selettiva che favorisce un tipo di variante monomerica sulle altre.

Bacillus rossius Il genere Bacillus comprende: B. rossius B. grandii B. atticus B. rossius-grandii B. whitei B. lynceorum B.rossius può presentare partenogenia bisessuali unisessuale Ibridi diploidi e triploidi non mendeliani

Areali di distribuzione del genere Bacillus:

Sulla base di allozimi, DNA satellite e dati mitocondriali B Sulla base di allozimi, DNA satellite e dati mitocondriali B.rossius e B.grandii sono altamente differenziati. B.grandii grandii mostra una alta affinità con le femmine automittiche partenogenetiche di B.atticus. I taxa del genere Bacillus condividono la stessa famiglia satellite centromerica Bag320.

MATERIALI E METODI I campioni raccolti in campo sono stati fatti crescere in laboratorio in gabbie aerate con cibo vegetale fresco. I corpi sono stati congelati e conservati a -80°C.

I monomeri Bag320 sono stati amplificati tramite PCR, con primers interni specifici progettati su una sequenza consenso derivata dal Bag320 di B.atticus e B.grandii analizzata in un precedente lavoro. Le sequenze sono state allineate e dopo aver osservato i livelli di variabilità e i trends sugli interi monomeri sono state ridotte alla lunghezza degli amplificati di B.rossius. Su di esse sono stati creati dendrogrammi di Neighbour Joining e cladogrammi di parsimonia.

RISULTATI I prodotti della PCR sono tutti monomeri di circa 250 bp più una seconda banda di circa 500 bp. Le analisi di sequenziamento sono state fatte sulla prima banda per 124 monomeri clonati con lunghezza media di 238 bp. Il confronto con sequenze satellite di altri taxa di Bacillus ha rivelato che le sequenze di Bag320 sono state amplificate tramite PCR. I monomeri Bag320 sono presenti in B.rossius ma in un numero molto basso di copie che le procedure standard di PCR possono non scoprire.

Cladogramma di massima parsimonia costruito sui 124 monomeri B.rossius forma un cluster con B.atticus e B.grandii grandii B.rossius forma un cluster con B.grandii benazzii e B.grandii maretimi

Cladogramma di massima parsimonia costruito su un sottogruppo di monomeri presi a caso Le sequenze di B.rossius mostrano differenze significative ma comunque uno specifico grado di affinità con le altre sequenze Bag320. Sono presenti monomeri clonati dallo stesso individuo di B.rossius in ognuno dei rami dell’albero, questo porta a ipotizzare un antenato che contenga tutte le diverse sequenze Bag320.

Ipotesi Library B.rossius accoglie ancora molta o tutta la variabilità della famiglia satellite Bag320 contenendo monomeri di ciascun taxon derivato e anche sequenze private mancanti negli altri taxa. Sembra che le sequenze Bag320 non siano state salvate come una componente maggiore del satellite ma semplicemente rappresentano il rimanente di una famiglia satellite ancestrale presente nell’antenato B.rossius.

Ancestral gene conversion events Nel cluster A1 sono presenti sequenze identiche in animali geograficamente distanti, tramite la gene conversion analysis sono stati trovati 2 putative converted tracts (PCT) che appartengono a sequenze di origine di B.atticus; lo stesso è accaduto per B.grandii grandii nel cluster A3. Il ritrovamento di sequenze uguali con uguali PCT in aree diverse suggerisce che gli eventi di gene conversion, che hanno prodotto il PCT (Cluster A1), sono capitati in un antenato B.rossius prima di 5.30-1.06 Mya. Nel cluster A3 invece si può supporre che l’evento di gene conversion sia accaduto, prima dell’antenato di B.grandii grandii, 15.37-2.65 Mya.

Variability trends and levels in B.rossius I campioni bisessuati delle tre sottospecie analizzate mostrano una variabilità significativa in tutti i livelli . Lo stesso accade nei campioni partenogenetici. La variabilità all’interno delle sottospecie invece non è significativa. In generale il valore di p-distance medio di B.rossius è più alta che in B.atticus e B.grandii.

Dai dati di variabilità appare chiaramente che il set di sequenze diverse ancora accolte nel genoma di B.rossius non è omogenizzato, neppure 16 Mya, probabilmente a causa del loro basso numero di copie. Il pattern della sequenza Bag320 odierna suggerisce che la riproduzione bisessuale attua la regola di fissazione solo per famiglie ben rappresentate nel genoma di un organismo. I livelli e i trends di variabilità delle sequenze Bag320 di B.rossius appaiono essere legati solo alla specifica storia di questa famiglia satellite nel taxon analizzato. FINE