PCR Polymerase Chain Reaction GENOMA UMANO: CIRCA GENI OTTENERE MOLTE COPIE DELLA STESSA SEQUENZA CLONAGGIO VETTORE: molecola di DNA che permette l’amplificazione della sequenza d’interesse La PCR è una tecnica biomolecolare che permette di copiare in vitro, in maniera esponenziale, una sequenza d’interesse.

PCR Miscela composta da: - Stampo - DNA pol - dNTP - Tampone - MgCl 2

5’-AAGTCGCCGTAAATGCGTACTGTTGCATGCGTAAATGCGCCCTGAAATCGATT-3’ 3’-TTCAGCGGCATTTACGCATGACAACGTACGCATTTACGCGGGACTTTAGCTAA-5’ Replicazione del DNA 5’-AAGTCGCCGTAAATGCGTACTGTTGCATGCGTAAATGCGCCCTGAAATCGATT-3’ 3’-TTCAGCGGCATTTACGCATGACAACGTACGCATTTACGCGGGACTTTAGCTAA-5’ 5’-AAGTCG C CGTATG AGCTAA-5’T T T A C A AGGG CGT CGC ACT TTA GTT CAT GCA ACG TGC CGT GTA CAA AAT TGA GCG GCA CCC TAC TGA ATT AAT GGC CGATT TTCAGC DNA pol Filamento stampo Innesco (primer) 3’- -3’

DNA polimerasi usate nella PCR: DNA polimerasi DNA-dipendente POLIMERASI Taq polimerasi: estratta del batterio termofilo Thermus aquaticus Nelle prime versioni della tecnica si utilizzava la polimerasi termolabile DNA pol I di E. Coli. oggi si utilizzano polimerasi termostabili non ha proofreading (3’-5’ esonucleasi) bassa fedeltà Pfu polimerasi: estratta dal batterio ipertermofilo Pyrococcus furiosus (correzione di bozza) presenta proofreading (3’-5’ esonucleasi) (correzione di bozza) alta fedeltà

INNESCHI Progettazione degli inneschi (primers): definizione della loro sequenza. È tra i fattori che maggiormente influenzano l’efficienza della reazione. 5’-AAGTCGCCGTAAATGCGTACTGTTGCATGCGTAAATGCGCCCTGAAATCGATT-3’ 3’-TTCAGCGGCATTTACGCATGACAACGTACGCATTTACGCGGGACTTTAGCTAA-5’ 5’-AAGTCGCCGTAAATGCGTACTGTTGCATGCGTAAATGCGCCCTGAAATCGATT-3’ 3’-TTCAGCGGCATTTACGCATGACAACGTACGCATTTACGCGGGACTTTAGCTAA-5’ 5’- TCGCC -3’ 3’- AACGT -5’ 5’- GTAAA -3’ 3’- AGCTA -5’ Inneschi (primers): Le DNA polimerasi hanno bisogno di una doppia elica di DNA, l’appaiamento dell’innesco con lo stampo fornisce la doppia elica e l’estremità 3’ OH a cui aggiungere i nucleotidi.

Caratteristiche degli inneschi Specificità: si ottiene quando una coppia di inneschi (primers) si lega in modo stabile esclusivamente alle sequenze complementari 5’-AAGTCGCCGTAAATGCGTACTATTGCATGCCTCAATGCGCCCTTAAATGGGTT-3’ 3’-TTCAGCGGCATTTACGCATGATAACGTACGGAGTTACGCGGGAATTTACCCAA-5’ Innesco1: TC Innesco2: AC TC CA PRODOTTO SPECIFICO PRODOTTO ASPECIFICO La dimensione media degli inneschi si aggira intorno ai 20 nucleotidi

Composizione delle basiContenuto in G + C compreso tra 40 e 60% LunghezzaTra i 18 e 25 nucleotidi SequenzaNo sequenze complementari nello stesso primer superiori a 3 basi Complementarietà tra i due inneschi Evitare la formazione di dimeri tra i due primers dovuti a sequenze complementari Estremità degli oligonucleotidiSe possibile l’estremità 3’ deve essere una C o una G Temperatura di fusione (melting temperature) Tm (°C): 2(A + T) + 4(G + C) Valida per primers di basi in soluzioni ad alta forza ionica (1 M NaCl) Tm (°C): 81,5 °C + 16,6 (log 10 [K + ]) + 0,41 (%[G+C]) – 675/n n: numero delle basi del nucleotide Valida per primers di in soluzioni a concentrazioni cationiche di 0,4 M o meno

STAMPO DNA genomico Es: studio di un gene o del promotore DNA genomico virale (diagnosi molecolare) Es: infezione da HPV (Human Papilloma Virus) cDNA DNA complementare Es: profilo di espressione genica RNA retrotrascrizione cDNA

Tampone: il più usato è il Tris-HCl che a temperatura ambiente stabilizza il pH della miscela di reazione intorno a 8,3-8,8. Deossiribonucleosidi trifosfato (dNTP): sono i mattoni di cui è costituito il DNA Cationi bivalenti: richiesti dall’enzima per svolgere la propria azione (Mg 2+ ) Gli altri elementi essenziali

FASI DELL’AMPLIFICAZIONE VENGONO RIPETUTE CICLICAMENTE 5’ 3’ 5’ 3’ DENATURAZIONEAPPAIAMENTO (ANNEALING)ALLUNGAMENTO 5’3’ 5’3’ DENATURAZIONEAPPAIAMENTO (ANNEALING)ALLUNGAMENTO 3’5’ 3’ DENATURAZIONEAPPAIAMENTO (ANNEALING)ALLUNGAMENTO

3 FASI DENATURAZIONE APPAIMENTO ALLUNGAMENTO ~ 30 CICLI DENATURAZIONE 94 °C APPAIAMENTO (ANNEALING) ~ 55 °C POLIMERIZZAZIONE 72 °C

3’5’ 3’ STAMPO 3’5’ 3’ 2 COPIE 3’5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 4 COPIE 8 COPIE

RT-PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction Si parte dall’RNA (totale o mRNA polyA + ) retrotrascrizione cDNA amplificazione della sequenza di interesse amplicone (prodotto di amplificazione) RT PCR

RETROTRASCRIZIONE Si basa sull’azione delle Trascittasi inverse, cioè di DNA polimerasi RNA-dipendente, polimerasi che usano uno stampo di RNA per produrre una copia di DNA. Le Trascrittasi inverse sono polimerasi che derivano dai retrovirus (virus ad RNA), che le usano per retrotrascivere il loro genoma. Essendo DNA polimerasi hanno bisogno di un innesco per iniziare la sintesi di DNA Nelle reazioni in vitro si usano oligonucleotidi d’innesco sequenza-specifici oppure una collezione di inneschi con sequenza random (casuale). Nel caso di inneschi sequenza-specifici viene retrotrascritto solo l’RNA d’interesse Nel caso della miscela di inneschi random vengono retrotrascritti tutti gli RNA

INNESCHI RAMDOM (CASUALI) A T G C 2 NUCLEOTIDI AA TT GG CC AT TA GA CA AG TG GT CT AC TC GC CG 3 NUCLEOTIDI AAA TTT... AAT TTA... AAG TTG AAC TTC ATA TAT ATG TGT ATC TCT AGA TGG AGT TAC... In genere si utilizzano oligonucleotidi d’innesco di circa 8 nucleotidi (pdn8)

5’-auucacccaaggcguguucagacuugggccacacguaccccaaauuaaaaaaaaaaa-3’ RNA d’interesse 3’-tgcatggggttta-5’ Miscela RNA Inneschi random retrotrascrizione Miscela di cDNA PCR con inneschi sequenza-specifici Innesco specifico Inneschi random

PROFILO TEMPORALE DI ESPRESSIONE GENICA BLASTULA → GASTRULA → SOMITOGENESI → PHARYNGULA (inizio) → PHARYNGULA (fine) → LARVA Zebrafish (Danio rerio) ESTRAZIONE RNA RETROTRASCRIZIONE cDNA PCR con inneschi gene-specifici

CORSA ELETTROFORETICA SU GEL DI AGAROSIO Donizetti et al., 2008