Trasformazione genica mediata dal DNA nei Mammiferi Per analogia con i trasposoni usati in Drosophila si è cercato di sviluppare vettori che avessero IR affinchè l ’ inserimento nel genoma fosse favorito; ciò è risultato vero solo per le cellule in coltura-> inserendo sequenze tra due IR si osservano integrazioni nel genoma MA SOLO di cellule in coltura; non avviene in modo efficace negli oociti dei Mammiferi. È stato necessario un cambio di strategia per ottenere topi transgenici: - il DNA da inserire deve essere LINEARE, meglio se fornito come CONCATENAMERO testa-coda - l ’ integrazione avviene a livello di 1 cellula

Microiniezione di DNA nell ’ oocita fecondato di topo Si preparano delle femmine per la superovulazione Si prelevano le uova e si mettono su un vetrino e si effettua una FECONDAZIONE in vitro Si aspetta altri 25 giorni e si preleva il sangue dalla coda e si controlla per Southern o per PCR se il DNA iniettato si è inserito Si impiantano tutti gli embrioni microiniettati in una o più femmine pseudogravide, si aspetta 20 giorni e nascono i topini Pipetta di fissaggio Pronucleo maschile Pipetta in cui è stato precedentemente preparato il DNA pulito, linearizzato da iniettare I topini che mostrano il transgene inserito si incrociano per verificare che lo trasmettano alla progenie (e che si sia quindi inserito nelle cellule germinali) -> si dice topo fondatore il topo che ha il transgene inserito STABILMENTE nel suo genoma

Topi transgenici per l ’ ormone della crescita di ratto (1982) Pronucleo femminile Pronucleo maschile DNA linearizza- to contenente il gene per l ’ ormone della crescita di ratto, rGH sotto il controllo del promotore della metallotioneina* (Mt-1), concate- namero di (6000 copie) Impianto in una madre adottiva lit/lit È stato subito evidente che questo topo aveva l ’ ormone della crescita di ratto inserito PROGENIE cresciuta su metalli pesanti Di 20 embrioni che si sono sviluppati 6 presentavano l ’ ormone della crescita di ratto, visto per Southern blotting controllo rGH Mt-1 -> la metallotioneina è una proteina, ricca di cisteine che si lega ai metalli pesanti (Zn), importante per la detossificazione; è regolata dagli stessi metalli pesanti e dai glucocorticoidi embrione omozigote per il gene del nanismo lit/lit (little) Topo lit/lit Topo lit/lit + rGH

Uso delle cellule embrionali staminali (ES) per ottenere topi transgenici Prelievo di cellule embrionali staminali da una blastocisti di topo Cellule ES Impianto in una madre pseudogravida Progenie chimerica Dopo un incrocio si ottiene il topo fondatore Un vantaggio di questo sistema è che inserendo come marcatore selezionabile il gene neo R insieme al gene da inserire, si possono selezionare direttamente le cellule ES che hanno integrato il DNA esogeno, facendole crescere su terreno con G418 Cellule ES trasformate con DNA di interesse e controllate per PCR o per Southern per verificare l ’ inserimento (si possono anche SELEZIONARE le cellule con il costrutto di interesse) Inserimento di cellule ES trasformate in una blastocisti Trasformazione delle cellule ES con DNA da inserire

Knock out di geni di topo Una delle applicazioni più frequenti della produzione di topi transgenici sono gli studi di GENOMICA FUNZIONALE -> l ’ identificazione della funzione di una sequenza di DNA mediante disattivazione del gene a funzione non nota ed analisi del fenotipo Gene di interesse ingegnerizzato neo R P gene normale neo R Appaiamento e crossing over RICOMBINAZIONE OMOLOGA Progenie chimerica, le parti che si sono sviluppate dalle cellule staminali sono nere Inserimento in cellule ES Pneo R Il gene inserito nelle cellule ES non è più funzionale L ’ incrocio delle chimere con omozigoti bianchi produce i topi fondatori, questi topi sono ETEROZIGOTI per il gene non funzionale. Incrociando gli eterozigoti tra loro si ottengono omozigoti per il gene mutato e si controlla il fenotipo Cellule staminali con il gene non funzionale (una copia) e omozigoti per il colore NERO del mantello Embrione omozigote per il colore BIANCO del pelo Impianto in una madre adottiva con pelo bianco Cellule con il gene alterato Cellule con il gene normale

Sistemi selettivi per eliminare eventi di RICOMBINAZIONE NON OMOLOGA Si usano costrutti che hanno il gene non funzionale (neo R ) e nello stesso costrutto è presente il gene per la timidina chinasi (tk), gene di herpesvirus Le cellule ES con questo tipo di costrutto inserito potranno crescere su neomicina e su GANCICLOVIR gene normale neo R RICOMBINAZIONE OMOLOGA tk neo R tk RICOMBINAZIONE NON OMOLOGA neo R tk Le cellule ES con questo tipo di costrutto inserito non potranno crescere su GANCICLOVIR (che uccide qualsiasi cellula che contiene il gene tk di herpesvirus) e quindi saranno eliminate Le cellule saranno coltivate in presenza di questo tipo di costrutto che verrà inserito nelle cellule ES. Il GANCICLOVIR è un analogo di un nucleoside e quando è inserito nella cellula è fosforilato dalla timidina chinasi ; quindi se è presente il prodotto della timidina chinasi che fosforila il GANCICLOVIR, la cellula incorpora l ’ analogo nel DNA è viene UCCISA! Se le cellule vengono coltivate in presenza di NEOMICINA (o G418) e di GANCICLOVIR* (specifico per herpesvirus)-> sopravviveranno solo le cellule che hanno il gene per la resistenza alla neomicina e che hanno effettuato una ricombinazione omologa solo così il gene tk non si sarà inserito, si procede poi come in precedenza per ottenere i fondatori prima e gli omozigoti poi.

Uovo fertilizzato 50  m Microiniezione del gene di interesse come DNA lineare nel pronucleo maschile embrione Si introducono embrioni micro- iniettati in madri adottive pseudo- gravide Nelle cellule somatiche delle progenie può essere evidente il DNA inserito ( se per esempio è un gene per il colore del mantello)  m Microiniezione del gene di interesse inserito nel vettore nelle cellule polari Embrione precoce Embrione Cellule polari Alcuni embrioni si svilupperanno e avranno nelle loro cellule germinali il gene di interesse È necessario un ulteriore incrocio per identificare i topi in cui il DNA si è inserito nella linea germinale e può quindi essere trasmesso a tutta la progenie stabilmente TOPI TRANSGENICI che avranno copie in tandem del gene inserite a caso in un cromosoma Drosophile TRANSGENICHE che avranno una singola copia del gene di interesse inserita in un cromosoma Tutte le Drosophile saranno incrociate per verificare la presenza del gene di interesse Confronto tra procedure di microiniezione

Probe A Knock out del gene krox 20 7,4 kb 6,3 kb Southern blot Mediante questo esperimento si è dimostrato che krox20 è un gene fondamentale per lo sviluppo nel topo Frammenti attesi dopo digestione con EcoRI (sonda A) 7,4 kb 6,3 kb Sonda A gene wild type allele mutante Vettore per la RICOMBINAZIONE OMOLOGA neo R pr1 pr2 neo R 7,4 kb 6,3 kb Sonda A

ANDi la prima scimmietta transgenica Il gruppo di Gerald Schatten nell ’ Oregon ha usato un vettore retrovirale ingegnerizzato per iniettare la GFP (Green Fluorescent Protein) di medusa in 224 oociti NON FERTILIZZATI di macaco (Rhesus monkey). ANDi Questi oociti sono stati poi fertilizzati mediante ICSI (Intra-Citoplasmatic Sperm Injection). Solo 20 hanno dato seguito alle divisioni e sono stati inseriti in madri adottive Si sono ottenute 5 gravidanze e da queste sono nati 3 maschi di macaco e uno di loro chiamato ANDi (inserted DNA ) mostrava il gene per la GFP inserito ed il mRNA prodotto nei suoi tessuti, ma nonostante la presenza della GFP la scimmietta non è verde ma di un bel colore marrone!

Alba (GFP Bunny) Alba è un coniglio femmina transgenico che contiene in tutte le sue cellule il gene GFP e quindi brilla di verde quando illuminato con la luce giusta. Questo coniglio è nato nel 2000 e fa parte di un “progetto di ARTE TRANSGENICA“ chiamata GFP Bunny, di un artista di Chicago: Eduardo Kac che si è avvalso della collaborazione di un Istituto francese di ricerca Il progetto prevedeva non solo la creazione del coniglio fluorescente, ma anche il dialogo generato dal progetto e l’integrazione dell’animale transgenico nella società (vive con l’artista) Il coniglio fluorescente ha fatto sorgere questioni etiche ed anche la domanda se questo tipo di sperimentazione può essere considerata ARTE

Altre applicazioni di topi transgenici È stato possibile eleborare modelli basati sul topo relativi a malattie genetiche nell ’ uomo : Morbo di Alzheimer artrite reumatoide distrofia muscolare oncogenesi disturbi neurovegetativi

Applicazione biotecnologica di un animale TRANSGENICO: produzione di una proteina di interesse farmacologico nel latte di una pecora Le uova iniettate vengono inserite nell ’ utero di una madre adottiva La progenie che esprime il transgene si identifica mediante analisi per Southern o PCR Nelle pecore transgeniche l ’ espressione è limitata al tessuto mammario Si frazionano le proteine del latte e si purifica la proteina di interesse Il gene di interesse viene linearizzato e inserito nel pronucleo Pipetta di sostegno promotore per la  lactoglobulina gene di interesse* Si raccoglie il latte delle pecore transgeniche * Si potrebbe trattare del gene che codifica per una proteina usata in campo terapeutico, per esempio il gene per l ’ attivatore del plasminogeno (TPA), somministrato per dissolvere i coaguli di sangue in pazienti umani

Elenco di alcuni prodotti BIOTECH ottenuti da OGM L ’ ormone umano della crescita, usato per curare il nanismo Il fattore tessutale  della crescita (TGF-  ) che stimola la produzione di nuovi vasi sanguigni e la crescita epidermica; utile per la rimarginazione di ferite e bruciature Il fattore VIII della coagulazione, usato per il trattamento dell ’ emofilia L ’ insulina umana ( “ umulina ” ) usata per il trattamento del diabete insulina-dipendente La DNAsi, per il trattamento PRECOCE delle infezioni croniche da Pseudomonas aeruginosa, che colpisce spesso i malati di fibrosi cistica Vaccini ricombinanti, per il trattamento di malattie virali umane ed animali (ad es. l ’ epatite B) L ’ ormone bovino della crescita, usato per aumentare le rese nelle razze bovine Il fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF), per il trattamento delle ulcerazioni croniche, nel trattamento delle ulcerazioni della pelle nei pazienti umani con diabete Batteri ed altri microorganismi geneticamente modificati per aumentare la produzione industriale per esempio di enzimi come l ’ amilasi, che scinde l ’ amido in glucosio, oppure per la produzione di acido citrico come additivo alimentare ecc. Batteri geneticamente modificati in modo da accellerare la degradazione di oli contaminanti o di alcuni prodotti chimici presenti in scorie tossiche come la diossina. Attivatore del plasminogeno tissutale, usato per prevenire o revertire la coagulazione sanguigna che avrebbe molti effetti deleteri

Clonazione: la pecora Dolly (Wilmut et al. 1997) Pecora donatrice Cellula mammaria Cellula uovo non fecondata Il nucleo viene eliminato pipetta Fusione e attivazione mediante una piccola scarica elettrica L ’ embrione viene coltivato in vitro Madre adottiva L ’ embrione viene impiantato nell ’ utero di una madre adottiva Da questo embrione si sviluppa un agnello del tutto simile alla pecora donatrice Dolly Separazione delle cellule e induzione al dedifferenziamento tenendole in un mezzo privo di nutrimento Epitelio mammario

Tappe della “ clonazione ” 22 Febbraio 1997-> pecora Dolly in Scozia (è morta per eutanasia per gravi problemi polmonari nel 2003; ha partorito 5 agnellini che stanno bene) 22 Luglio 1998->topi clonati nelle Haway 9 Dicembre 1998-> vitelli clonati in Giappone 16 Dicembre 1998->embrione umano clonato a Seul (l ’ esperimento è stato interrotto) Gennaio 2000->clonaggio di ANDi da cellule embrionali di macaco in Oregon (il primo PRIMATE transgenico) 2000->maialini clonati in Gran Bretagna per gli xenotrapianti 25 Novembre > La Advanced Cell Technology (USA) annuncia di aver eseguito la prima clonazione di un embrione umano fermandola a livello di 6 cellule! Gli esperimenti di clonazione hanno un ’ alta incidenza di malformazioni (14%) contro il 3% nei normali