Metodologia Clinica II ANATOMIA PATOLOGICA (programma) Definizione e genesi dei tumori. Nomenclatura e classificazione delle neoplasie. Anatomia patologica della progressione neoplastica. Criteri morfologici generali per la diagnosi delle neoplasie. Definizione delle lesioni preneoplastiche. Invasione e metastasi. Stadiazione e grado di differenziazione delle neoplasie. Finalità e metodi dell’esame necroscopico. Principi e finalità della immunoistochimica. Immunoistochimica prognostica e predittiva. Applicazione di tecniche biomolecolari in Anatomia patologica. Esercitazioni: Esame macroscopico e campionamento. Allestimento del materiale istologico congelato. Allestimento del materiale istologico paraffinato: fissazione, inclusione, taglio e colorazione dei preparati. Immunoistochimica: principali antigeni e relativi anticorpi. Osservazione al microscopio di casi istologici allestiti con colorazioni standard e con colorazioni istochimiche o immunoistochimiche. Applicazioni diagnostiche della immunoistochimica e delle tecniche biomolecolari .

ANATOMIA PATOLOGICA Anatomia Patologica: generalità Il laboratorio di Anatomia Patologica per comprendere il flusso di lavoro nelle sue diverse fasi con particolare riferimento al ruolo del patologo Principali strumenti di indagine in anatomia patologica morfologica (istologia bioptica, istologia su pezzo operatorio, esame al criostato, citologia esfoliativa e per aspirazione con ago sottile,) Patologia molecolare applicata (immunoistochimica, biologia molecolare) e possibili applicazioni e rilevanza di tali strumenti nelle indagini di prevenzione (screening citologici e molecolari), nella pratica diagnostica clinica e nella valutazione dei parametri prognostici e predittivi Negli ultimi anni l’anatomia patologica da branca della medicina dedicata allo studio e Classificazione delle malattie, esclusivamente dal punto di vista morfologico, aderendo alle richieste dei clinici e dei pazienti si è, di fatto, evoluta in “patologia molecolare” con il compito di fornire i dati su alterazioni geniche o su biomarcatori presenti nei tessuti patologici, che possono essere indispensabili per l’accurata impostazione di terapie mirate a bersaglio molecolare (target therapy).

ANATOMIA PATOLOGICA

L’attività diagnostica dell’Anatomo Patologo si esplica in tutti i campi della patologia In campo oncologico definisce la natura della lesione, identifica fattori prognostici e predittivi di risposta terapeutica, utilizzando tecniche di immuno-fenotipizzazione e molecolari, e fornisce di conseguenza gli elementi fondamentali e indispensabili per una scelta terapeutica mirata. Nell’ambito della prevenzione oncologica il patologo è il medico responsabile della diagnostica cito-istologica dei programmi di screening e produce una diagnosi che condiziona i successivi comportamenti clinico-terapeutici. Nell’ambito dei trapianti d’organo il patologo ha un ruolo nella valutazione della idoneità dell’organo e successivamente monitorizza l’eventuale patologia da rigetto e patologie associate. Nell’ambito delle patologie infettive, il patologo, attraverso la morfologia e tecniche di immunofenotipizzazione e molecolari, contribuisce alla identificazione degli agenti patogeni, segnatamente nelle infezioni opportunistiche in soggetti immunodepressi. Il patologo interviene nella definizione diagnostica di un’ampia gamma di patologie degenerative, dismetaboliche, immunitarie, malformative e infiammatorie. e nell’identificazione e caratterizzazione nelle cosidette “malattie rare”. Tra le indagini diagnostiche svolte dall’anatomo patologo vi è l’autopsia che ha permesso la nascita della medicina moderna e ha costituito il caposaldo dell’accertamento diagnostico clinico quando non erano disponibili indagini strumentali in vivo. Con l’evoluzione delle diagnostica strumentale si è venuta progressivamente riducendo la necessità di ricorrere al riscontro autoptico per identificare le alterazioni patologiche degli organi interni. Un utilizzo del riscontro autoptico è rappresentato dallo studio delle patologie dello sviluppo fetale con il duplice scopo di documentare e confermare eventuali anomalie di sviluppo e contemporaneamente investigare le cause di patologia perinatale. L’attività diagnostica svolta nel servizio di anatomia patologica si esplica attraverso l’emissione di un referto che verrà comunicato al richiedente (clinico o paziente) tramite un atto scritto e firmato dal medico anatomo patologo.

Anatomia Patologica è una disciplina morfologica Analisi delle conoscenze dallo studio delle modificazioni dell’aspetto (morfologia) cui vanno incontro organi, tessuti o cellule come conseguenza dello stato di malattia. Può essere suddivisa in: Anatomia patologica macroscopica = modificazioni morfologiche già visibile a occhio nudo Anatomia patologica miscroscopica (istopatologia) = che necessita dell’ausilio del miscroscopio ottico Anatomia patologica ultrastrutturale = modificazioni subcellulari che necessitano del miscroscopio elettronico Anatomia patologica molecolare = quando non ci sono modificazioni morfologiche caratteristiche ma è necessario indagare sulle proteine e/o acidi nucleici -immunoistochimica -biologia molecolare

Morfologia

Flusso di lavoro in Anatomia Patologica il medico che effettua il prelievo: Effettua la biopsia sul paziente Pone la biopsia in un contenitore con formalina al 10% Etichetta il contenitore con le generalità del paziente Compila un modulo di richiesta esame Il tecnico/infermiere di anatomia patologica che accetta il prelievo: Verifica che il materiale inviato sia in formalina e corrisponda a quello descritto nella richiesta Verifica che il modulo di richiesta sia stato compilato in ogni sua parte Assegna al caso un numero di protocollo L’anatomopatologo: Descrive il materiale che ha ricevuto in esame Effettua uno o più prelievi di tessuto non più grandi di 1-2 cm da cui allestire i preparati istologici Pone i prelievi in biocassette di plastica Il tecnico di anatomia patologica che allestisce i preparati istologici: Pone le biocassette nel processore dei tessuti Include il tessuto processato in un blocchetto di paraffina Taglia, colora e monta le sezioni su un vetrino Consegna i vetrini all’anatomopatologo L’anatomopatologo Esamina i preparati istologici al microscopio Formula la diagnosi Scrive il referto Invia il referto al medico che ha effettuato il prelievo

Flusso di lavoro in Anatomia Patologica Preparati istologici Accettazione dei campioni (infermiere) 5) Taglio* - microtomo - criostato 6) Colorazione* 7) Montaggio* 8) LETTURA AL MICROSCOPIO OTTICO (medico) 2) Fissazione* - Formalina…. 3) PRELIEVI (medico) 4) Inclusione * - paraffina….. (*tecnico di laboratorio biomedico)

Esame Istologico Estemporaneo (Diagnostica intraoperatoria) L'esame intraoperatorio viene richiesto: per chiarire la diagnosi di malattia, nel caso questa non sia già stata posta in precedenza, o quando durante l'operazione emergano nuovi quesiti diagnostici. L'esame istologico intraoperatorio si esegue effettuando sezioni al microtomo congelatore/criostato) Consiste in una biopsia in cui prelievo e diagnosi avvengono durante l'intervento chirurgico. Al fine di garantire tempi di lavorazione estremamente brevi, la biopsia viene congelata all'interno di un particolare strumento denominato criostato all'interno del quale il campione viene posto con un particolare gel (OCT) su di un supporto speciale e quindi esposto a temperature molto basse (-35°). In questo modo la biopsia è in grado di congelarsi in pochi minuti ed essere pronta al taglio da parte del tecnico di laboratorio In seguito il vetrino così allestito verrà colorato con sostanze coloranti specifiche (colorazione con ematossilina-eosina) per i tessuti ed una volta montato sarà pronto per la lettura al microscopio. Il Medico Specialista in Anatomia Patologica pone la diagnosi su una sezione così allestita. Il Tempo medio di allestimento di un esame intraoperatorio è di 10-15 minuti dall'arrivo del tessuto nel laboratorio e comunque nel minor tempo possibile.

Microtomo Criostato

La diagnostica intraoperatoria in An. Pat La diagnostica intraoperatoria in An. Pat. a Ferrara è garantita dalle ore 8.00 alle ore 18.00 Lun./Ven. (1 tecnico/1 patologo)

Flusso di lavoro in Anatomia Patologica Preparati istologici Accettazione dei campioni (infermiere) 5) Taglio* - microtomo - criostato 6) Colorazione* 7) Montaggio* 8) LETTURA AL MICROSCOPIO OTTICO (medico) 2) Fissazione* - Formalina…. 3) PRELIEVI (medico) 4) Inclusione * - paraffina….. (*tecnico di laboratorio biomedico)

Fissazione Trattamento chimico che porta alla immobilizzazione e alla stabilizzazione di componenti tessutali con minima dislocazione ed estrazione dei composti nativi La FORMA delle cellule e dei tessuti deve venir conservata il più possibile simile alla condizione vitale Una fissazione ideale prevede: Stabilizzazione contro modificazioni successive indotte da trattamenti susseguenti quale l’inclusione in paraffina Simultaneità nel campione della reazione tessuto-fissativo ( rapida penetrazione e diffusione nei tessuti ) Riproducibilità del processo di fissazione nonostante differente composizione del tessuto Assenza di “anormali” componenti prodotti o estrazione di componenti native Rapidità di azione ( per evitare l’insorgere di autolisi ) Assenza di “sovra-fissazione”

La diagnosi istopatologica, che si basa sullo studio della morfologia, richiede l’ uso di fissativi idonei a preservare nello statu quo ante migliore possibile la struttura del campione. La fissazione di un tessuto fornisce quindi una immagine statica, la quale, benché non ne rappresenti proprio le caratteristiche dell’ aspetto in vivo, deve tuttavia essere costantemente riproducibile. Requisiti fondamentali del fissativo ideale : sicura preservazione della morfologia di base integrità della struttura antigenica impedimento di alterazioni biochimiche nei tessuti, per aggiunta o sottrazione di componenti chimiche opposizione ai processi autolitici e putrefattivi.

Fissazione Tecniche di fissazione : per immersione, consistente nel sommergere il tessuto nel liquido fissativo, con rapporto volumetrico minimo tra fissativo e campione di 10 : 1 per perfusione, in assoluto la migliore da un punto di vista teorico - pratico, ma limitata all’ animale da esperimento o ad organi asportati in loco e con vasi integri per uso di vapori, secondo cui i tessuti si fissano grazie ai vapori che si liberano da una soluzione fissativa riscaldata, permettendo così una fissazione in situ (si evita in tal modo che alcune sostanze solubili possano diffondere in soluzione e disperdersi). Si usano fissativi altamente volatili come : formaldeide, glutaraldeide, acido osmico.

Fissazione La Formalina: E’ il più diffuso ed usato fissativo in istopatologia Ha un valore di pH neutro, prossimo a 7.0 Molecola di basso peso molecolare capace di penetrate rapidamente nei tessuti, con la formazione di gruppi idrossi-metile con le proteine, e con la formazione di legami di tipo metilenico tra catene polipeptidiche (cross-linking) Formalina al 10%: formaldeide polimerizzata in soluzione acquosa satura al 40% e successivamente diluita 1:10 (detta anche formaldeide 4%) Formalina salata: 100 ml di formaldeide al 40% + 9 gr di NaCl + 900 ml di H20; è una soluzione isotonica che impedisce la coartazione ed il rigonfiamento cellulare Formalina tamponata: 100 ml di formaldeide 40% + 900 ml di H20 + 4 gr di fosfato acido di sodio + 6.5 gr di fosfato disodico anidro; impedisce l’acidificazione dei tessuti (fenomeno dovuto alla trasformazione della formaldeide in acido formico), mantenendo il pH a 7.0.

Formalina La formalina agisce stabilendo dei ponti aldeidici tra le proteine dei tessuti e quindi fissandole nella posizione originaria ottenendo la cosiddetta “reticolazione” con la creazione di un ponte metilico tra i diversi gruppi, aminici, ossidrilici ecc… contenenti idrogeno attivo andando a formare dei legamo crociati. Le proteine fissate non avranno più attività enzimatica, né saranno capaci di diffondere impedendo l’autolisi dovuta a enzimi proteolitici

Formalina Importante rispettare i tempi di fissazione troppo lunga: può interferire sulle colorazioni di immunoistochimica e su indagini molecolari troppo breve: può causare deterioramento del campione con perdita della architettura del tessuto La formalina è classificata come cancerogeno ed irritante deve essere usato sotto cappa aspirante (con guanti, occhiali e camice) e i contenitori con formalina devono essere conservato ben chiusi in armadi con aspirazione forzata a 23-25°C per impedire la diffusione dei vapori

Altri Fissativi Gluteraldeide: ha una penetrazione nei tessuti inferiore alla formalina ed è utilizzata per allestire preparati per la miscroscopia elettronica Alcool assoluto: si usa quando si vuole preservare il glicogeno Acetone : conserva alcuni enzimi come le lipasi e le fosfatasi Alcool assoluto e Acetone sono usati nei preparati citologici in quanto causano distorsione nucleare e retrazione del citoplasma

Miscele Fissative Si possono usare invece che un singolo fissativo delle miscele con più fissativi combinati per eliminare o limitare i difetti dei singoli: Liquido di Bouin (molto penetrante) Liquido di Carnoy (fissativo rapidi per piccoli campioni) Liquido di Zenker (fissativo di elezione per il tessuto linfopoietico per l’ottimo mantenimento dettagli cellulari)

Flusso di lavoro in Anatomia Patologica Preparati istologici Accettazione dei campioni (infermiere) 5) Taglio* - microtomo - criostato 6) Colorazione* 7) Montaggio* 8) LETTURA AL MICROSCOPIO OTTICO (medico) 2) Fissazione* - Formalina…. 3) PRELIEVI (medico) 4) Inclusione * - paraffina….. (*tecnico di laboratorio biomedico)

Scopo allontanamento dell’acqua dai tessuti fissati Dopo la fissazione Disidratazione Diafanizzazione Scopo allontanamento dell’acqua dai tessuti fissati Togliendo l’acqua il tessuto diviene più duro e quindi più facile da tagliare E’ possibile poi includere il tessuto in un mezzo idrofobico (paraffina)

Disidratazione Con alcool etilico a concentrazione crescente per evitare la coartazione del pezzo Concentrazione dell’alcool etilico dal 50-70% al 100% con tempi di permanenza variabili da 15’ a 1h a seconda delle dimensioni del pezzo, tempo e volume del alcool sono direttamente proporzionali alla dimensione del pezzo Si possono usare per la disidratazione anche butanolo, alcool isopropilico, acetone….

Diafanizzazione Il tessuto disidratato deve essere incluso in paraffina, sostanza che non è solubile in acqua e neppure in alcool E’ necessario usare in solvente che allontani l’alcool e che abbia affinità con la paraffina XILOLO (anche toluolo e benzene) La diafanizzazione dura 2-3 ore

Inclusione Tecnica di inclusione in paraffina : Si effettua di routine su campioni privi di problemi particolari, tenendo presente che, con essa, si rendono solubili e si asportano dai tessuti i grassi. La paraffina (a punto di fusione di 58 - 60 °C) è chimicamente inattiva e conserva bene i tessuti che devono essere disidratati con immersione in alcool etilico (70°, 95° 99°) e diafanizzati con solventi della paraffina (cloroformio, benzene, toluene, xilene) prima di venire impregnati in essa e successivamente inclusi in blocchetti. In genere, il processo di inclusione avviene mediante l’ uso di inclusori automatici, fatti funzionare in ore notturne, e di dispensatori di paraffina, utilizzati per ottenere dei blocchetti ben compatti che contengono il tessuto pronto per essere sezionato con gli appositi microtomi.

Inclusione Paraffina Gelatina / Agar Celloidina Resine

INCLUSIONE (in paraffina)

Flusso di lavoro in Anatomia Patologica Preparati istologici Accettazione dei campioni (infermiere) 5) Taglio* - microtomo - criostato 6) Colorazione* 7) Montaggio* 8) LETTURA AL MICROSCOPIO OTTICO (medico) 2) Fissazione* - Formalina…. 3) PRELIEVI (medico) 4) Inclusione * - paraffina….. (*tecnico di laboratorio biomedico)

ISTOLOGIA Dopo l’inclusione in paraffina dei campioni in precedenza fissati preparazione microtomo e bagno termostatato stendi-sezioni raccolta sezioni istologiche di circa 3 µ su vetrini; loro fissazione in stufa a secco termostatata; e procedimento deparaffinazione in solventi

TAGLIO AL MICROTOMO

Flusso di lavoro in Anatomia Patologica Preparati istologici Accettazione dei campioni (infermiere) 5) Taglio* - microtomo - criostato 6) Colorazione* 7) Montaggio* 8) LETTURA AL MICROSCOPIO OTTICO (medico) 2) Fissazione* - Formalina…. 3) PRELIEVI (medico) 4) Inclusione * - paraffina….. (*tecnico di laboratorio biomedico)

ISTOLOGIA colorazione manuale o automatizzata delle sezioni su vetrino colorazione di routine E.-E. colorazioni speciali reazioni specifiche di immuno-isto-chimica montaggio vetrini in mezzo di inclusione idoneo

COLORAZIONE E MONTAGGIO

Colorazioni Colorazione base Colorazioni speciali istochimiche Ematossilina/Eosina Colorazioni speciali istochimiche Van Gieson (muscolo) Tricromica di Masson (collageno-muscolo) PAS (glicogeno, mucine, menbrane basali, miceti)

I preparati istologici vengono colorati con Ematossilina-Eosina (Em-Eo) E’ una colorazione bicromica che si basa sul diverso valore di pH dei vari tessuti e dei vari organelli costituenti la cellula. Il nucleo e i vari componenti acidi del citoplasma (ribosomi, secreti acidi) vengono colorati in viola dall’ematossilina, che è un colorante basico, il citoplasma e i vari tessuti basici (muscolare, connettivo, osseo) vengono colorati in rosa, più o meno intenso, da una miscela acida di eosina-orange G.

ISTOLOGIA apposizione etichette identificative sui vetrini contenenti le sezioni colorate archiviazione in apposite rastrelliere delle cassettine per istologia contenenti le inclusioni in paraffina consegna dei vassoi contenenti i vetrini al medico anatomo-patologo specialista osservazione dei vetrini al microscopio ottico interpretazione e diagnosi da parte del medico anatomo-patologo specialista refertazione su apposito modulo di profilo mirato e relativa consegna in segreteria amministrativa archiviazione dei vetrini diagnosticati in istoteche