ESTRAZIONE DNA ANALISI QUANTITATIVA ANALISI QUALITATIVA (GEL DI AGARAROSIO) PCR (semiquantitativa) PURIFICAZIONE DEL DNA SEQUENZIAMENTO ANALISI BIOINFORMATICA DIGESTIONE CON ENZIMI DI RESTRIZIONE

Isolamento acidi nucleici SI EFFETTUA IN BASE : Tipo di acido nucleico Fonte (tessuti animali, vegetali, eucarioti, procarioti, virus) Materiale di partenza (organo intero, tessuto, coltura cellulare, sangue etc) Applicazione prevista post-estrazione (PCR, marcatura, restrizione enzimatica, southern blotting, RT-PCR etc)

COME DETERMINARE LA CONCENTRAZIONE DEL ACIDO NUCLEICO ESTRATTO Letture spettrofotometriche a 260nm 1 OD = 50 g/ml di DNA 1 OD = 40 g/ml di RNA Il rapporto tra le OD misurate a 260 nm e 280 nm fornisce una indicazione della purezza dell’acido nucleico esaminato Una soluzione di DNA o RNA puro dovrebbe avere un rapporto A260/A280 di 1,8 e 2,0 rispettivamente.

QUALITA’ DEL DNA ESTRATTO

ELETTROFORESI SU GEL DI AGAROSIO Principio: Consente di separare molecole cariche grazie all’applicazione di un campo elettrico Il DNA, carico (–) a pH neutro, migra verso il polo positivo(anodo).

Da cosa dipende la velocità di migrazione DIMENSIONE DEL DNA CONCENTRAZIONE DI AGAROSIO NEL GEL CONFORMAZIONE DEL DNA VOLTAGGIO APPLICATOcirca 5 Volt/cm (distanza anodocatodo) PRESENZA DI BROMURO DI ETIDIO COMPOSIZIONE (FORZA IONICA) DEL BUFFER

D-Galattosio-3,6-Anidro-L-Galattosio L’agarosio è un polimero lineare che forma una matrice semisolida avente pori di dimensione diversa in funzione dellaconcentrazione utilizzata La sua concentrazione determina il potere risolutivo del gel

La percentuale di agarosio viene scelta in base alla grandezza del DNA che vogliamo separare: AGAROSIO 0,3% PER SEPARARE DNA A DOPPIO FILAMENTO DI DIMENSIONI TRA 5-60Kb AGAROSIO 0,8% PER SEPARARE DNA A DOPPIO FILAMENTO DI DIMENSIONI TRA 0,5-10Kb AGAROSIO 2% PER SEPARARE DNA A DOPPIO FILAMENTO DI DIMENSIONI TRA 0,1-3Kb

I CAMPIONI DI DNA VENGONO MISCELATI AD UN COLORANTE CON FUNZIONE DI ADDENSANTE E INDICATORE DEL FRONTE ELETTROFORETICO

Reazione a Catena della Polimerasi (PCR) (Mullis, 1985 –Premio Nobel nel 1993) Reazione enzimatica in cui frammenti di DNA compresi tra due brevi oligonucleotidi sintetici (primer) sono amplificati in modo esponenziale ed altamente specifico

Amplificazione esponenziale 1°ciclo 2°ciclo 3°ciclo 4°ciclo DNA “target” 235= 34 miliardi 35 cicli

ELEMENTI FONDAMENTALI Taq DNA Polimerasi (Thermophilus aquaticus) 2) Primers 3) Nucleotidi fosforilati (dATP, dCTP, dGTP,dTTP) 4) DNA bersaglio (“target o template”) 5) Tampone (buffer) 10X 6) Termociclatori automatici e termostabili

30-40 cicli Annealing 50-60°C Denaturazione 94-95°C Estensione (Extension) 72°C

Tm= 4(nG + nC) + 2(nA + nT)°C

CONCENTRAZIONE DELLA BANDA DI INTERESSE

ELETTROFEROGRAMMA

Enzimi di restrizione o Deossiribonucleasi Idrolizzano i legami fosfodiesterici sul DNA Ognuno ha una propria sequenza consenso (sito di restrizione) I siti di restrizione sono costituiti da sequenze palindromiche

Gli enzimi di restrizione possono effettuare un taglio sfalsato (sticky ends) o orizzontale (blunt ends)

APPLICAZIONI Degradazione di filamenti estranei al genoma (procarioti) Clonaggio molecolare Analisi degli RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Taglio in frammenti più corti di molecole di DNA di grandi dimensioni

Frammento di DNA utilizzato

Digestione del frammento di DNA con Bam HI o Nco I