Cromatografia Il termine cromatografia indica un insieme di tecniche che hanno lo scopo di separare una miscela nei suoi componenti, per permetterne il riconoscimento qualitativo e quantitativo Queste tecniche sono basate sulla distribuzione differenziale dei vari componenti fra due fasi, una chiamata fase stazionaria e una fase mobile, che fluisce in continuo attraverso la fase stazionaria

Tecniche cromatografiche  In base alla forma del letto cromatografico Cromatografia su colonna (impaccata, open-tubular) Cromatografia planare (su carta, su strato sottile)  In base allo stato fisico della fase mobile Cromatografia Liquida (LC) Gascromatografia (GC) Cromatografia fluida supercritica (SFC)  In base al meccanismo di separazione Adsorbimento Ripartizione Scambio ionico Esclusione Affinità

Basi del procedimento cromatografico  il campione è introdotto nella fase mobile, che può essere un gas, un liquido  la fase mobile viene fatta eluire in continuo attraverso la fase stazionaria, che immiscibile nell’eluente  la fase stazionaria (liquida o solida) si trova all’interno di una colonna oppure è supportata su una superficie piana  la fase mobile e la fase stazionaria sono scelte in modo che i componenti della miscela da separare si distribuiscano tra le due fasi i componenti più affini alla fase stazionaria passeranno più tempo in questa fase, quindi si sposteranno più lentamente attraverso il sistema i componenti più affini alla fase mobile si sposteranno invece più velocemente  la separazione dei componenti avviene in quanto ogni sostanza ha una distribuzione caratteristica tra le due fasi (costante di ripartizione K d =C s /C m )

Principio fondamentale Coefficiente di ripartizione: definisce come un composto si distribuisce tra due fasi non miscibili Kd = concentrazione nella fase A/ concentrazione nella fase B Coefficiente effettivo di ripartizione: definisce la quantità totale di sostanza presente in una fase / quantità totale nella seconda fase= kd

Che vuol dire? Kd=1 vuol dire che la concentrazione del composto nella fase A e B è uguale ma se il composto si ripartisce in 10cm 3 di A e 1cm 3 di B la quantità totale di composto presente nella fase A è 10 volte maggiore della quantità di sostanza in fase B

Tempo di ritenzione o di eluizione Tr: Tempo impiegato da ciascun composto x emergere dalla colonna Tr è differente x ciascun analita Volume di ritenzione o di eluizione Vr: Volume necessario x eluire un composto Vr= Tr x Fc Fc : velocità di flusso della Fase mobile

Il tempo di ritenzione t R è il tempo che impiega un componente della miscela iniettata ad uscire dalla colonna o, tecnicamente, ad essere rivelato come picco dal detector. Un tipico cromatogramma per una miscela a due componenti ha due situazioni diverse: il picco a sinistra rappresenta un soluto che non ha alcuna interazione con la fase stazionaria ed esce al cosiddetto tempo morto, t M il picco a destra rappresenta un soluto che ha, invece, interazione con la fase stazionaria ed esce al tempo t R > t M Tempo di ritenzione

Oltre al tempo di ritenzione t R, è possibile quantificare l’interazione di un soluto con la fase stazionaria in due modi: mediante il volume di fase mobile V R necessario per eluire il soluto, V R = t R x F ; F = velocità di flusso mediante il fattore di capacità K’, espresso come la differenza tra il tempo di ritenzione ed il tempo morto in unità di tempo morto:

Da cosa dipende Vr Dimensioni della colonna ( diametro e lunghezza) Dimensioni, forma e porosità delle particelle della fase stazionaria Viscosità della fase mobile

Tipi di Cromatografie 1- Cromatografia su colonna di vetro 2- Cromatografia su strato sottile 3- Cromatografia su carta

Forma del letto cromatografico Cromatografia su colonna: la fase stazionaria è contenuta all’interno di una colonna cilindrica, che può riempire completamente (colonna impaccata) oppure rivestirne la superficie interna (colonna tubulare) Cromatografia planare: la fase stazionaria è distribuita su una superficie piana, che può essere un supporto cartaceo (cromatografia su carta, PC) o una lastrina in vetro o altri materiali (cromatografia su strato sottile, TLC) In base alla forma del letto cromatografico su cui è realizzato il processo separativo, possiamo le seguenti varianti:

Cromatografia su colonna di vetro Fase stazionaria è attaccata ad un supporto inerte (matrice) e posta nella colonna, Fase mobile liquida e passa attraverso la fase stazionaria x gravità attraverso un sistema di pompe

Cromatografia su strato sottile Fase stazionaria (silice) è attaccata ad un supporto adatto posto su una lastra di vetro o plastica Fase mobile liquida liquida che passa x capillarità lungo la lastra Vantaggio: separazione di più campioni

Cromatografia su carta Fase stazionaria liquida ( acqua, una sostanza non polare)è legata alle fibre di cellulosa della carta Fase mobile liquida che passa x capillarità lungo la carta

Cromatografia planare su carta o TLC L’esecuzione dell’analisi è molto semplice: la miscela da separare va depositata sulla superficie, posandone con un tubo capillare una goccia su una linea che segna l’inizio del processo di eluizione Quindi il foglio o la lastrina si pongono in una vaschetta contenente la fase mobile che per gravità (modalità discendente), per capillarità (modalità ascendente) fluisce sulla fase fissa trascinando gli analiti e separandoli

Metodica TLC o cromatografia su carta

Cromatografia planare Il risultato è (spesso ma non sempre) visualizzabile sotto forma di macchie colorate, ognuna dovuta ad un componente della miscela. Il riconoscimento delle sostanze può avvenire effettuando separazioni su miscele standard; in questo caso il parametro che caratterizza i soluti separati è il cosiddetto Rf o fattore di ritardo. Per ogni analita il valore di Rf si ottiene misurando la distanza percorsa dal centro della macchia e confrontandola con la distanza percorsa dal fronte dell’eluente: Rf = d analita / d eluente Il valore di Rf degli analiti è quindi sempre compreso tra 0 e 1. I valori ottimali sono compresi tra 0.4 e 0.8 Uso di standard x individuare i campioni dei quali si conosce la migrazione

Visualizzazione dei risultati Nel caso le macchie non siano colorate, è possibile ricorrere a due metodi per visualizzare il risultato della separazione: utilizzare una lampada UV per irraggiare la lastrina, se le sostanze separate non assorbono la luce visibile ma assorbono nell’ultravioletto ( < 400 nm); può essere necessario addizionare alla fase stazionaria o alla fase mobile un indicatore di fluorescenza che permette di localizzare le macchie spruzzare la lastrina con una soluzione contenente sostanze in grado di reagire con i costituenti della miscela separata, generando composti colorati; può essere necessario scaldare leggermente la lastrina per favorire la reazione

Irraggiamento con UV Separazione di coloranti antrachinonici con TLC e illuminazione con lampada UV a 254 nm (dx); l’intensità delle macchie può essere valutata con un colorimetro (sotto)

Addizione di reagenti cromogeni Nell’immagine sotto è mostrato un contenitore per l’aspersione di ninidrina su lastrine TLC o PC Alcuni esempi di reagenti correntemente impiegati per evidenziare le macchie sono riportati nella tabella sottostante ReagenteUtilizzo Iodio in EtOHper composti azotati AgNO 3 in NH 3 per sostanze riducenti Alizarinaper cationi Ninidrinaper amminoacidi e ammine HS 2 per cationi e metalli pesanti

Cromatografia planare bidimensionale Per aumentare la separazione tra gli analiti e quindi la loro identificazione è possibile effettuare l’eluizione lungo due dimensioni, prima lungo un asse e poi, girando a 90° la lastrina, lungo l’asse ortogonale, evenutalmente con una fase mobile differente: in questo modo le macchie sono separate in maniera più efficiente Sotto: separazione di aminoacidi

Cromatografia liquida su colonna: rapporto di partizione o capacità Tempo trascorso dall’analita nella fase stazionaria rispetto a quello trascorso in fase mobile K’ = CsVs + kd Vs CmVm Vm Cs e Cm: concentrazioni dl composto nella fase stazionaria e mobile Vs e Vm: Volume della fase stazionaria e mobile Vs/Vm= rapporto volumetrico di fase=  K’ = CsVs + kd  CmVm

Piatti teorici Il sistema cromatografico è immaginato come una colonna composta da una serie di strati sottili chiamati piatti teorici; in ognuno di questi microelementi della colonna si realizza l’equilibrio di distribuzione del soluto tra fase stazionaria e fase mobile. I termini numero di piatti teorici (N) e altezza del piatto (HETP, Height Equivalent to Theoric Plate) sono comunemente utilizzati in cromatografia per quantificare le prestazioni dei sistemi cromatografici HETP = lunghezza colonna /N Più lunga è la colonna, + sono i piatti teorici, maggiore è la risoluzione della colonna

Visualizzazione della separazione Ponendo all’uscita della colonna un rivelatore che misuri la concentrazione del soluto nell’eluito (cioè la fase mobile che esce dalla colonna) e riportando il segnale in funzione del tempo si può ottenere un cromatogramma La posizione dei picchi sull’asse dei tempi, o tempo di ritenzione, serve per identificare i componenti del campione L’area sottesa dai picchi è proporzionale alla quantità di ogni singolo componente e può essere utilizzata a scopo quantitativo

Piatti teorici Il sistema cromatografico è immaginato come una colonna composta da una serie di strati sottili chiamati piatti teorici; in ognuno di questi microelementi della colonna si realizza l’equilibrio di distribuzione del soluto tra fase stazionaria e fase mobile. I termini numero di piatti teorici (N) e altezza del piatto (HETP, Height Equivalent to Theoric Plate) sono comunemente utilizzati in cromatografia per quantificare le prestazioni dei sistemi cromatografici HETP = lunghezza colonna /N Più lunga è la colonna, + sono i piatti teorici, maggiore è la risoluzione della colonna

Separazione ottimale a)separazione con scarsa risoluzione e basso N b)migliora la risoluzione ma è sempre basso N c)ottima risoluzione e buono N

Cromatografia su colonna Apparecchiature: Colonna di vetro Pompa collegata da un lato al Serbatoio con fase mobile e dall’altro alla colonna Collettore di frazioni

Preparazione della colonna Impaccamento della colonna Caricamento del campione Eluizione della colonna Raccolta delle frazioni Rivelazione

Impaccamento della colonna - Versare nella colonna la fase stazionaria aggiunta di fase mobile x equilibrare la colonna

Caricamento del campione Aspirare la fase mobile sulla colonna Stratificare delicatamente il campione sulla fase stazionaria Far passare fase mobile

Eluizione colonna Fase mobile deve essere pompata attraverso la colonna a velocità costante attraverso una pompa peristaltica La quantità di liquido che esce dalla colonna non deve superare quella che entra Eluizione isocratica: singolo solvente Eluizione in gradiente: solventi a diverso pH o forza ionica

Raccoglitore di frazioni e rivelazione Collettore posto sotto la colonna Raccolte frazioni a tempi prescelti di un certo volume Costruzione di un cromatogramma

Tipi di matrici: supporto alla fase stazionaria Matrici sono specifiche x la fase stazionaria Scelta della fase stazionaria è strettamente correlata al tipo di cromatografia

Caratteristica delle matrici Elevata stabilità meccanica: assicura elevate velocità di flusso e minimizza la cadute di pressione lungo la colonna Gruppi funzionali specifici x legare la fase stazionaria Le particelle di matrice devono avere dimensioni e forma adatte, porosità definita Inerte x evitare adsorbimento aspecifico del materiale

Vari tipi di cromatografie su colonne Cromatografia x gel filtrazione Cromatografia a scambio ionico Cromatografia di assorbimento

Cromatografia ad esclusione molecolare o gel filtrazione Principio : separazione delle molecole in base al loro PM Colonne sono più lunghe di quelle adoperate nelle altre cromatografie, x Aumentare la quantità di fase stazionaria nella colonna Aumentare la quantità di volume dei pori

Fasi stazionarie Gel idrofilici con legami crociati: Destrano ( Sephadex) Agarosio (Sepharose, Bio-Gel A) Poliacrilammide (Bio-Gel P) Polistirene ( Bio-beads S)

Fase mobile Un’unica fase mobile in isocratica

La fase stazionaria è un solido poroso o un gel. Le molecole dell’analita, disciolte nella fase mobile, penetrano nei pori se le loro dimensioni sono compatibili e vi rimangono per un certo tempo; le molecole più grandi sono invece escluse dai pori ed escono dalla colonna in tempi brevi

Vt Vt= V 0 +kd V i Kd (0, 1)

Dopo l’eluizione Cromatogramma (Assorbimento delle frazioni a 280nm se sono proteine)

Applicazioni Purificazione di macromolecole biologiche ( proteine, enzimi, acidi nucleici, ormoni, ) Determinazione del PM di un composto puro

Determinazione del PM di un composto puro ( scopo analitico) Standard a PM noto V eluizione Riporto in grafico il PM sul Ve ( retta di taratura Carico il composto puro sulla colonna Vedo il suo Ve Posso determinare il PM x estrapolazione sulla retta di taratura

Concentrazione di soluzioni su Sephadex G-25 Per concentrare soluzioni contenenti proteine ad alto PM 1- si aggiunge sephadex G 25 secca alla soluzione acquosa contenente proteine Man mano che il gel si rigonfia assorbe H2O e proteine a basso PM Le proteine ad alto PM restano in soluzione Dopo 10 minuti il gel viene allontanato x centrifugazione Soluzione di proteine ad alto PM più concentrata

Sephadex G-25: Dissalazione di composti ad alto PM Colonna di sephadex G-25 Carico la soluzione proteica contenente proteine a diverso PM e Sali Le proteine ad alto PM subito eluite Le proteine a basso PM eluite più lentamente Per ultimi eluiti i sali

Sephadex G-25: applicazioni Per allontanare i Sali dai campioni separati mediante cromatografia a scambio ionico

Cromatografia a scambio ionico Principio: separazione di composti in base alla loro carica Aa, proteine possiedono gruppi ionizzabili e la loro carica netta positiva o negativa dipende dal pka e dal pH della soluzione secondo la legge di Handerson- Hasselbach pH= pka + log [forma non ionizzata]/ [forma ionizzata]

Fase stazionaria Resina o matrici con gruppi carichi positivamente o negativamente chiamate Scambiatori cationici ( gruppi negativi) Scambiatori anionici ( gruppi positivi)

Scambiatori cationici Usati x stabilire interazioni con molecole cariche positivamente

Scambiatori anionici Usati x stabilire interazioni con molecole cariche negativamente

Matrici Polistirene Agarosio Cellulosa

Scambiatori Cationici forti SO 3 - gruppi solfonato legati alla cellulosa -CH 2 SO 3 - Solfometile legato al destrano -(CH 2 ) 3 SO 3 - Solfopropile legato al polistirene Scambiatori forti: sono completamente ionizzati a qualsiasi pH si lavori

Scambiatori cationici deboli -COOH gruppo carbossilico legato ad agarosio -CH 2 COOH carbossimetile a cellulosa

Scambiatori anionici forti -CH 2 N(CH 3 ) 3 trimetilamminometile a cellulosa -(CH 2 ) 2 N(CH 3 ) 3 trietilamminometile a destrano

Scambiatori anionici forti -(CH 2 ) 2 NH 3 + amminoetile a agarosio -(CH 2 ) 2 NH(CH 2 CH 3 ) 2 dietilamminoetile a cellulosa

Come si sceglie lo scambiatore? Deve tener conto. Stabilità dei componenti del campione Masse molecolari

Stabilità del campioni Molte proteine sono stabili solo in un ristretto intervallo di pH ( denatura) X Proteina stabie a valori di pH superiori al suo PI avrà carica negativa userò uno scambiatore anionico X Proteina stabile a valori di pH inferiori al suo PI avrà carica positiva userò uno scambiatore cationico X Proteina stabile in un ampio intervallo di pH potrò usare entrambi

Quando uso scambiatori forti? Se devo separare elettroliti deboli, che richiedono pH estremi x ionizzarsi, perché gli scambiatori forti sono stabili in un ampio intervallo di pH

Elettroliti forti, che si ionizzano facilmente Quando uso scambiatori deboli? Vantaggi degli scambiatori deboli Minore tendenza a denaturare il campione Minore tendenza a legare le impurità fornite di carica presenti nel campione Caratteristiche migliori di eluizione

Tampone di equilibrio del campione, scambiatore Il valore di pH del tampone deve essere di almeno una unità inferiore o superiore del pI del composto da separare Con scambiatori anionici si usano tamponi cationici ( tris, piridina) Con scambiatori cationici si usano tamponi anionici ( acetato, fosfato)

Controllo del pH e forza ionica del tampone Controllati xchè si deve garantire il legame allo scambiatore dei componenti del composto da separare Eluizione poi viene condotta in gradiente di pH o forza ionica crescente

Gradiente di pH e forza ionica con scambiatori anionici Gradiente di pH decrescente Forza ionica crescente Gradiente di pH e forza ionica con scambiatori cationici Gradiente di pH e Forza ionica crescenti

Cromatografia a scambio ionico

Separazione di aa da un idrolizzato proteico Scambiatore cationico forte Campione caricato su colonna in tampone pH1-2, così tutti gli aa si legano allo scambiatore Eluizione in gradiente crescente di ph e forza ionica

Come vengono eluiti gli aa Ordine di eluizione: aa acidi ( aspartato, glutammato) aa neutri (glicina, valina) Aa basici ( lisina e arginina) che mantengono la loro carica positiva fino a pH 9-10

Cromatografia di affinità Principio: separazione in base all’affinità di un composto (proteina, enzima) x un ligando ( Substrato) Il legame tra ligando e proteina deve essere reversibile Ligando viene legato ad una matriceinsolubile

Quanto campione si carica Il volume del campione =non più del 5% del volume della colonna

P + L PL Proteina ligando complesso legato alla matrice

Matrici Particelle sferiche, uniformi e rigide: Destrani avario grado di legami crociati ( Sephacryl S) Gel di poliacrilammide ( Bio-Gel P) Cellulosa polistirene

Caratteristiche matrice Gruppi chimici adatti a legare il ligando Stabile al legame dell’E e all’eluizione Evitare adsorbimento aspecifico

Applicazioni con acidi nucleici Per separare mRNA ( coda di poli(A)) si utilizza una ibridazione su poli(U) Sepharose Immobilizzo DNA a singola elica su una matrice posso isolare DNA e RNA complementare

Cromatografia di affinità con lectine Lectine: gruppo di proteine prodotte da animali, piante e muffe Funzione: legare carboidrati ( sono glicoproteine) Molte con struttura tetramerica Possono legarsi a specifici residui saccaridici x cui sono utili x purificare glicoproteine e recettori proteici di membrana

Metodica Estrazione di lecitine da fagiolo, pisello Immobilizzate su matrici di agarosio Si carica il campone contenente le glicoproteine Eluizione in vari modi

Eluizione Tampone contenente un eccesso di monosaccaride x il quale la lectina ha affinità Tampone borato, forma complessoncon la glicoproteina staccandola dalla lectina Aggiunta al tampone di polietilenglicole che riduce la quota di interazioni idrofobiche tra lectina e glicoproteine

Applicazione Separare un enzima Lego alla matrice inibitore competitivo Impacco la colonna Carico il campione E- si lega all’Inibitore Gli altri componenti vengono eluiti L’Enzima viene eluito in Tampone con alte concentrazioni di S

Cromatografia di immunoaffinità Matrici sono immobilizzati anticorpi specifici Isolamento di specifiche proteine Immobilizzazione a pH neutro

Anticorpi Immobilizzati su agarosio tramite Bromuro di Cianogeno NH -OH + BrCN - O-C N O-C-NH Anticorpo Matrice con gruppo ossidrilico Matrice attivata anticorpo immobilizzato

Eluizione l’alta affinità della proteina all’anticorpo, l’eluizione spesso richiede condizioni estreme, x cui c’è rischio di denaturazione Alte concentrazioni di Sali in presenza o meno di detergenti (SDS, urea, guanidina cloridrato)

Cromatografia di affinità con metalli immobilizzati Ione metallico (Cu 2+, Zn 2+, Hg 2+,Cd 2+ ) Ioni di transizione (Co 2-, Ni 2-, Mn 2- ) immobilizzati su agarosio Legame con: residui istidinici (gruppo imidazolico), cisteinici (tiolo), tiptofano della proteina (indolo)

Eluizione Complesso proteina-metallo viene destabilizzato mediante diminuzione di pH Applicazioni: Purificazione di proteine: Fibrinogeno Superossido dismutasi Proteine nucleari non istoniche

Cromatografia di affinità con ligandi colorati Purificare proteine che si legano a coloranti contenenti anelli coniugati o doppi legami Coloranti sono detti Pseudo Ligandi, xchè il legame con le proteine non è specifico come negli altri casi di cromatografia di affinità Interazione con la proteina è non specifica ( interazioni ioniche ed idrofobiche) e avviene a pH 7-8.5

Vantaggi Basso costo dei coloranti ( cybacron blue F3G-A) Facile immobilizzazione su matrici Stabilità di legame con le matrici

Eluizione Gradiente salino

Cromatografia covalente Purificare proteine con gruppi tiolico-SH Immobilizza sulla matrice un L con gruppi disolfurico S-S Il gruppo tiolico della proteina compete con uno S del ponte disolfuro e si lega al L Si libera piridin-2-tione ( anello aromatico) assorbe a 343nm, x cui si può registrare in continuo l’assorbimento della proteina Eluizione: Tampone con DTT o beta mercaptoetanolo

Rigenerazione del gruppo tiolico del L legato alla matrice Quando la proteina si stacca dal ligando P-SH, sulla matrice si deve ristabilire il S-S e l’anello aromatico Per la rigenerazione del ligando sulla matrice si usa 2,2 dipiridilsolfuro

Limiti delle cromatografie su colonna descritte Il potere risolutivo di una colonna aumenta : -all’aumentare della lunghezza della colonna -Quanto più piccole sono le dimensioni delle particelle di fase stazionaria ma……..

Quanto più piccole sono le dimensioni delle particelle di fase stazionaria maggiore è la resistenza al flusso di solvente Si genera una contropressione che può danneggiare la fase stazionaria

HPLC Nuova tecnica che consente la separazione di molecole utilizzando: Fasi stazionarie costituita da particelle di piccole dimensioni, in modo tale che possano sopportare pressioni elevate Colonne di acciaio inossidabile che sopportano pressioni fino a Pa

Colonne Lunghezza 15-20cm Diametro 1-2mm Colonne microbore: 2-3mm di diametro, 25cm di lunghezza Colonne preparative : diametro 25mm, sopportano Velocità di flusso fino a 100cm 3 min -1

Matrici 3 tipi di matrici: -Supporti microporosi- i micropori si ramificano all’interno delle particelle -Supporti pellicolari- supporti in cui i micropori sono solo sulla superficie di un solido inerte -Fasi legate- le fasi stazionarie sono legate chimicamente a supporti inerti di silice

Fasi stazionarie e fase mobile in HPLC in fase normale Fase stazionaria- è polare (nitrile) Fase mobile- solvente apolare( esano)

Fasi stazionarie e fase mobile in HPLC in fase inversa Fase stazionaria- è apolare (octasilano) Fase mobile- solvente polare (acqua/acetonitrile, acqua/metanolo)

Fasi mobili Dipendono dal tipo di separazione. Colonna a scambio ionico: gradiente di pH Colonna x gel filtrazione. Eluizione in isocratica

Metodica Standard Separazione campione Rivelazione campioni Analisi qualitativa e quantitativa

Strumentazione per HPLC Un cromatografo HPLC è costituto dalle seguenti parti: riserva di solventi: uno o più solventi che possono essere utilizzati singolarmente o in miscela pompa con pressione fino a 400 Atm, flusso stabile tra 0.1 e 10 ml/min sistema di iniezione costituito da una valvola a più vie e da un circuito a volume fisso, o loop, nel quale si mette il campione colonna cromatografica ed eventuale precolonna rivelatore per monitorare gli eluati PC per gestire il sistema e i dati

Gascromatografia per la separazione di sostanze volatili. Si presta meno facilmente a misure quantitative, in compenso ha maggiori potenzialità dal punto di vista diagnostico. Si possono separare sostanze appartenenti a varie classi tra cui, aromi (terpeni, esteri) idrocarburi a catena corta acidi carbossilici composti di interesse biochimico

il campione è vaporizzato e poi iniettato in colonna; un gas costituisce la fase mobile ma in questo caso non ha alcuna interazione con i soluti in quanto agisce soltanto da carrier, cioè trasporta i soluti lungo la colonna I composti iniettabili in un sistema GC devono avere T eb < 300°C e non devono essere termolabili, ovvero non devono degradarsi per effetto della temperatura,

Gascromatografia Gas-liquido –Supporto( materiale granulare inerte solido) –Fase stazionaria liquido non volatile, legato covalentemente con alto punto di ebollizione (silicone) –meccanismo di ripartizione. I composti si ripatiscono tra la fase liquida stazionaria e la fase mobile gas( azoto, elio, argon) – utile x separare composti poco polare

Caricamento dei Campioni I campioni poco polari sono direttamente applicati sulle colonne I campioni polari prima sottoposti a silanizzazione, metilazione, x renderli più volatili Prima di essere caricati i campioni sono sciolti in. Acetone Eptano, metanolo

rivelazione Rivelatore a ionizzazione di fiamma: Fiamma è generata xchè nel rivelatore è iniettato una miscela di idrogeno e aria Man mano che i composti escono dalla colonna vengono ionizzati dalla fiamma Produce un intenso segnale che passa al registratore