TB: una malattia riemergente Medici senza frontiere incontra la realtà locale Diagnostica microbiologica attuale della TB dott. Marco Arosio Bergamo, 25 settembre 2010 Bergamo Direttore dott. Antonio Goglio

Diagnosi Microbiologica Esame microscopico Diagnosi molecolare diretta Esame colturale Identificazione Antibiogramma Diagnosi immunologica di TBC latente

Campioni per la ricerca dei micobatteri

Diagnosi Microbiologica Esame microscopico Diagnosi molecolare diretta Esame colturale Identificazione Antibiogramma Diagnosi immunologica di TBC latente

Esame microscopico Colorazione: - Ziehl-Neelsen - Kinyoun Fluorescenza Tecnica scarsamente sensibile e non specie-specifica Indicato per tutti i campioni ad eccezione delle emocolture

Esame microscopico: Ziehl-Neelsen 100x

Esame microscopico: fluorescenza 40x

Tabella interpretativa

Diagnosi Microbiologica Esame microscopico Diagnosi molecolare diretta Esame colturale Identificazione Antibiogramma Diagnosi immunologica di TBC latente

Sensibilità Campioni respiratori % nei campioni microscopico-positivi % nei campioni microscopico-negativi Campioni extra-polmonari % nei campioni microscopico-positivi % nei campioni microscopico-negativi Sensibilità - Specificità della PCR Specificità Molto buona, range tra %

Vantaggi molto più rapida eseguibile anche su campioni pesantemente contaminati Svantaggi non altrettanto sensibile non rileva i micobatteri appartenenti ad altre specie false negatività dovute agli inibitori false positività dovute a contaminazioni costo elevato esecuzione complessa PCR vs esame colturale

Algoritmo interpretativo

microscopia negativa (3 campioni) amplificazione negativa (2 campioni) amplificazione negativa (2 campioni) amplificazione positiva (2 campioni) amplificazione positiva (2 campioni) amplificazioni discordanti (2 campioni) amplificazioni discordanti (2 campioni) TBC ulteriori indagini non TBC Algoritmo interpretativo

microscopia positiva (1, o più campioni) amplificazione positiva (1 campione) amplificazione positiva (1 campione) amplificazione negativa (2 campioni) amplificazione negativa (2 campioni) monitoraggio degli inibitori monitoraggio degli inibitori TBC presenti assenti micobatteriosi ripetizione del test Algoritmo interpretativo

Indicazioni generali E’ pertanto sempre necessario oltre alla PCR l’esecuzione dell’esame microscopico e colturale che rimane l’indagine “gold standard” La PCR puo’ rimanere positiva anche dopo la negativizzazione dell’esame colturale al termine della terapia, deve quindi essere utilizzata: - SOLO IN FASE DIAGNOSTICA - E NON NEL FOLLOW-UP TERAPEUTICO

Diagnosi Microbiologica Esame microscopico Diagnosi molecolare diretta Esame colturale Identificazione Antibiogramma Diagnosi immunologica di TBC latente

Terreni di coltura Terreni solidi Terreni liquidi - Sensibile ma richiede da una a otto settimane - Problema delle contaminazioni

Velocità di crescita Aspetto delle colonie Crescita a varie temperature Test di inibizione selettiva Identificazione tradizionale: test colturali

Diagnosi Microbiologica Esame microscopico Diagnosi molecolare diretta Esame colturale Identificazione Antibiogramma Diagnosi immunologica di TBC latente

Mycobacterium tuberculosis complex

Tecniche molecolari Sonde Sequenziamento

Diagnosi Microbiologica Esame microscopico Diagnosi molecolare diretta Esame colturale Identificazione M. tuberculosis complex MOTT (Micobatteri non tubercolari) Antibiogramma Diagnosi immunologica di TBC latente

Resistenze di M. tuberculosis complex Esclusivamente cromosomiche Sviluppo spontaneo di mutanti resistenti con frequenza compresa fra 1x10 -6 e 1x10 -8 Selezione di mutanti resistenti in caso di terapie inappropriate - Antibiogramma diretto: relativamente rapido ma con alta incidenza di contaminazioni - Antibiogramma da ceppo isolato: tempi lunghi

MDR - M.tuberculosis MDR MDR = Multidrug resistant resistente almeno ai due principali farmaci isoniazide e rifampicina XRD XRD = Extensive drug resistant resistente: a tutti i farmaci di prima scelta, ai fluorochinoloni, ad almeno uno dei tre farmaci iniettabili: capreomicina, kanamicina, amikacina

Farmaci antitubercolari di prima scelta ISONIAZIDE: battericida, attiva sui batteri in rapida crescita, inibisce la sintesi degli acidi micolici. RIFAMPICINA: battericida, attiva sui batteri in rapida crescita che su quelli intracellulari a crescita rallentata, inibisce la sintesi proteica PIRAZINAMIDE: battericida (in associazione con l’isoniazide), a PH acido, sui batteri intracellulari, meccanismo d’azione sconosciuto ETAMBUTOLO: batteriostatico, attivo sui batteri in rapida scescita, inibisce la sintesi della componente glucidica della parete STREPTOMICINA: battericida, attiva solo sui batteri extracellulari in rapida crescita, blocca la sintesi proteica

Antibiogramma tradizionale Metodo delle proporzioni: su Lowenstein-Jensen: gg su 7H10/11: gg in terreno liquido (radiometrico, fluorescenza) 5-12 gg

Diagnosi Microbiologica Esame microscopico Diagnosi molecolare diretta Esame colturale Identificazione Antibiogramma Diagnosi immunologica di TBC latente

Tubercolosi Latente

Storia naturale dell’infezione da M. tuberculosis complex Esposizione al M. tuberculosis complex Non infezione Infezione TB primaria nei primi due anni dopo l’infezione Infezione tubercolare latente Controllo immunitario a lungo termine Riattivazione della tubercolosi Mantenimento per tutta la vita 5% 95% 5% 95%

The current diagnostic test for latent TB Diagnosis of latent TB relies on the 100-year old skin test. It is the oldest diagnostic test still in use. Poor specificity: antigenic cross- reactivity of PPD with BCG and environmental mycobacteria Poor sensitivity: 75-90% in active disease (lower in disseminated TB and HIV infection) Need for return visit Operator variability (inoculation & reading) Painful inflammation & scarring

TestIGRA (Interferon-gamma releasing assay) Test IGRA (Interferon-gamma releasing assay) T SPOT-TB (Oxford Immunotech) QuantiFERON-TB Gold (Cellestis)

Naive T cell Effector T cells + MTB antigens Effector T cells require continual presence of antigen Risposta immune dopo infezione con MTB complex

Naive T cell Effector T cells + MTB antigens If treatment is successful and no antigen remains, what happens to the T cells? Risposta immune dopo infezione con MTB complex

Destino dei linfociti T No antigen Effector T cells 90% 10% Apoptosis Memory T cells

Effector cells produce IFN-  within a few hours of stimulation Memory cells must differentiate, and take >24 hours before significant IFN-  production hour incubation.  The IFN-  is from effector T cells & these cells need antigen to survive Produzione di IFN- 

Antigens are all taken from the RD1 region of M. tuberculosis. RD1 is absent from all BCG strains (lost during original derivation of M. bovis BCG from M. bovis between 1908 and 1921 at Institut Pasteur) Crucially, therefore, does not give false positive results in BCG vaccinated individuals. Test Immunologici

Specie - Specificita’ di ESAT-6 e CFP-10 Environmental strains Antigens ESATCFP M abcessus-- M avium-- M branderi-- M celatum-- M chelonae-- M fortuitum-- M gordonii-- M intracellulare-- M kansasii++ M malmoense-- M marinum++ M oenavense-- M scrofulaceum-- M smegmatis-- M szulgai++ M terrae-- M vaccae-- M xenopi-- Antigens ESATCFP M tuberculosis++ BCG substrain gothenburg-- moreau-- tice-- tokyo-- danish-- glaxo-- montreal-- pasteur--

Linee guida CDC e NICE

Entrambe le linee guida incoraggiano l’applicazione dei test immunologici su sangue (in alternativa o in combinazione con il test cutaneo) per la diagnosi di infezione tubercolare latente negli adulti. Inoltre sono espressamente indicate diverse aree (diagnosi di tubercolosi attiva, impiego nei soggetti con infezione da HIV, bambini < 5aa,...) in cui sono necessari ulteriori studi. Indicazioni CDC e NICE

Algoritmo dell’Iter Diagnostico dei Micobatteri Grazie per l’attenzione