(2012/2013) LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGICHE DEL FARMACO INSEGNAMENTO DI UNIVERSITA’ DEGLI STUDI NAPOLI FEDERICO II Titolare Dr. Roberto Russo FARMACOLOGIA APPLICATA

MANIFESTAZIONI DELL’ANSIA Il soggetto si ritiene eccessivamente ansioso quando compaiono sintomi quali: Irrequietezza, tachicardia, aumento della sudorazione, disturbi del sonno, disturbi g.i., crisi di pianto Interferenza con la normale attività produttiva Ansia fobica, crisi di panico I Farmaci utilizzati sono le benzodiazepine (Rec GABAa); agonisti del Rec 5HT1A e 3 (riducono liberazione 5HT).

Test in vitro

[ 3 H]-GABA receptor binding Il [ 3 H]-GABA si lega al suo recettore presente su preparazioni di membrana sinaptica di cervello di mammifero PROCEDURA Si preleva rapidamente il cervello di ratto ( g) e si pone in ghiaccio Si effettuano una serie di omogeneizzazioni e centrifugazioni a 4°C al fine di ottenere un pellet di membrane sinaptiche. Il pellet è congelato a -80°C. Il pellet è sospeso in tampone TRIS-maleato ed omogenato a 4°C, in presenza di Triton-X (37°C per 30 minuti); centrifugazione per allontanare il surnatante. I campioni così ottenuti sono pronti per l’incubazione a 4°C per 5 minuti con: - [ 3 H]-GABA - [ 3 H]-GABA + muscimolo o isoguvacina - [ 3 H]-GABA + campione Si lava il campione (2x), si blocca la reazione. Si aggiunge il liquido di scintillazione e si legge la radioattività con il  counter

Valutazione dei risultati Il legame specifico del [ 3 H]-GABA sul recettore sinaptico è inversamente proporzionale alla radioattività rivelata. [ 3 H]-GABA = radioattività totale [ 3 H]-GABA + muscimolo o isoguvacina = radioattività residua dallo spiazzamento del [ 3 H]-GABA da parte dello std Ciò significa che la quantità del complesso [ 3 H]-GABA-recettore diminuirà all’aumentare della concentrazione di std (o di campione) [ ] ligando freddo cpm [ 3 H ]-GABA-R [ 3 H ]-GABA libero

5-HT 1A receptor binding La 8-idrossi-2-(di-n-propilamino)-tetralina (DPAD) è un agonista selettivo del R 5-HT 1A Il composto marcato [ 3 H]-DPAD si lega ai R presenti nell’ippocampo di ratto Il binding del [ 3 H]-DPAD risulta un metodo sensibile per valutare potenziali agonisti serotoninergici specifici per il sottotipo 5-HT 1A

PROCEDURA Si preleva l’ippocampo di ratto ( g), che viene rapidamente pesato ed omogenato Si effettuano una serie di omogeneizzazioni e centrifugazioni al fine di ottenere un pellet di membrane sinaptiche. Il pellet è sospeso in un tampone adatto. I campioni così ottenuti sono incubati a 25°C per 15 minuti con: - [ 3 H]-DPAD - [ 3 H]-DPAD + 5-HT (10  M) - [ 3 H]-DPAD + campione Si lava il campione (2x), si blocca la reazione. Si aggiunge il liquido di scintillazione e si legge la radioattività con il  counter

Valutazione dei risultati Il binding specifico si definisce come la differenza tra Binding totale e binding in presenza di 5-HT (10 µM). Bs = Btot – B 5HT Le IC 50 sono calcolate dal binding specifico per ogni concentrazione del campione testato

Test in vivo

- test di aggressività (aggressione da isolamento) - ansia indotta da situazioni nuove od ostili: -test anti-ansia (modelli luce-buio) -anticipatory anxiety, -social interaction test, -distress vocalization, -ansia indotta da stati conflittuali: -defensive buring in mice, -test di Vogel, -test di Geller-Seifter - studi comportamentali: tamburo ruotante, activity cage, hole-board test, labirinto ad Y, rotador method - modelli di memoria ed apprendimento: active e passive avoidance test

Test di aggressività - aggressione da isolamento

Aggressione da isolamento Topi sottoposti ad isolamento sviluppano un comportamento aggressivo PROCEDIMENTO: Topo in isolamento per 6 settimane Un topo “sociale” è messo insieme al topo isolato Il topo “isolato” attacca l’intruso VALUTAZIONE: Tempo di attacco F antidepressivi e neurolettici sono attivi Modifica del metodo: “maternal aggression” (si introduce un “intruso” nella gabbia di un topo che ha partorito da poco tempo).

Ansia indotta da situazioni nuove od ostili - test anti-ansia (modello luce-buio) - anticipatory anxiety test - social interaction test - distress vocalization

Test anti-ansia nel topo (modello luce/buio) Il topo tende ad esplorare nuovi ambienti ma teme gli spazi molto illuminati. Ponendo l’animale in condizione di scegliere tra un angolo buio ed uno spazio illuminato preferirà l’angolo buio, il numero di passaggi tra i due ambienti aumenta somministrando l’ansiolitico

Procedura L’apparecchio consta di due camerette di diversa dimensione; la piccola è BUIA la grande è ILLUMINATA. La connessione tra le due aree è provvista di fotocellula. Topi maschi (18-25 g) vengono trattati con la sostanza in esame Dopo minuti gli animali vengono posti nell’apparecchio e monitorati per 10 minuti Il numero di passaggi tra le due zone sarà proporzionale all’azione dell’ansiolitico

Test dell’ansia anticipatoria nel topo Aumento della T °C rettale in topi che prevedono una situazione ostile Se da una gabbia di 10 topi ne allontano uno alla volta, l’ultimo topo rimasto in gabbia avrà la temperatura rettale più alta della media. Tale fenomeno viene interpretato come ansia anticipatoria per un evento avverso. La misura della temperatura rettale dell’ultimo topo rimasto in gabbia è il parametro da valutare nello studio di un f. ansiolitico.

Vengono quindi allontanati i rimanenti topi uno alla volta lasciandone nella gabbia tre topi. A questi ultimi tre topi verrà misurata la temperatura corporea. La differenza tra la temperatura media di questi topi e quella basale sarà il parametro considerato. In letteratura il gruppo di controllo mostra un variazione di temperatura di ° C Procedura Gruppi di 18 topi (25-30 g) vengono posti per 7 gg in una gabbia apposita a temperatura ed umidità costante Il veicolo, f. da testare e/o il controllo positivo vengono somministrati per via orale 30 minuti prima del test Dopo 30 minuti vengono allontanati i primi 3 topi e viene effettuata la misura della temperatura rettale con un termometro (2 mm di diametro) posto per 2.5 cm nel retto. Il valore medio rappresenterà la temperatura di riferimento.

Test dell’interazione sociale nel ratto In un ambiente ostile ed illuminato le normali interazioni sociali tra i ratti (annusarsi, leccarsi, mordersi) sono inibite. Tale inibizione del normale comportamento è indice di uno stato ansioso Il recupero da tale inibizione è il parametro da valutare nello studio di un f. ansiolitico

Procedura: L’apparecchio consiste in una scatola di plexiglass senza coperchio, illuminata con una luce di 60 W posta a 20 cm di distanza, con delle aree distinte sul pavimento. Gli animali utilizzati sono ratti maschi ( g) Il veicolo, f. da testare e/o il controllo positivo vengono somministrati per via orale 1 ora prima del test a due ratti (prelevati da gabbie diverse). Dopo 1h vengono posti nella scatola e vengono osservati per 10 minuti due tipi di comportamento: - misura del tempo (in secondi) durante il quale gli animali interagiscono (interazione sociale) - conta del numero di passaggi da un area all’altra della scatola (esplorazione dell’ambiente) E’ necessario utilizzare almeno sei coppie di animali per singola dose di farmaco da testare. Il valore medio ottenuto dalle coppie- controllo sarà comparato con quello delle coppie-trattate.

Distress vocalization in rat Aumento dei suoni emessi da cuccioli (9-12 giorni) tenuti per la coda per 30 secondi PROCEDIMENTO Mattino: selezione dei ratti, sono esclusi quelli che emettono meno di 50 ultrasuoni in 60 secondi. Pomeriggio: si effettua il test Il farmaco da testare somministrato per os o ip riduce il numero di «vocalization» rispetto al gruppo di animali trattati con il solo veicolo Apparecchio per ultrasuoni

Ansia indotta da stati conflittuali test di Vogel, test di Geller-Seifter, conditioned defensive burying

Test di Vogel Ratti assetati ricevono scosse elettriche (1mA) mentre bevono Importante è l’intensità della corrente, nè troppo bassa, tale da non essere avvertita come nociva nè troppo alta, tale da scoraggiare del tutto l’animale. VALUTAZIONE: numero di scosse ricevute LIMITI: escludere che il F sia analgesico, sedativo, modifichi la sete

Test di Vogel F ansiolitici o ipnotici «disinibiscono» l’animale che nonostante le scosse elettriche continua a beve. Le Valutazioni possono essere fatta verso il gruppo controllo e/o verso un f. standard

Test di Geller-Seifter Ratti affamati ricevono scosse elettriche quando si procurano cibo PROCEDIMENTO: Animali tenuti a dieta (riduzione del 20% peso) Allenamento a procurarsi latte zuccherato premendo una leva Scossa elettrica quando si preme la leva (stato conflittuale)

VALUTAZIONE: Numero di volte in cui viene premuta una leva sia nello stato conflittuale (effetto ansiolitico) sia nel periodo non conflittuale (effetto sedativo) Ogni ratto è paragonato a sé stesso (giorno precedente) CRITICHE: costo, tempo, difficoltà ad ottenere la ED 50

Defensive burying Topi/ratti coprono con la segatura delle biglie poste nella gabbia PROCEDIMENTO: Animali sono posti in gabbie dove ci sono 10 biglie VALUTAZIONE: Numero di biglie non sepolte (2/3 non coperte da segatura) in 60 minuti F antidepressivi e neurolettici sono attivi Modifica: piccola scossa quando toccano le biglie

Studi comportamentali - hole-board test - rotarod method - activity cage - labirinto ad Y

Dell’ATTIVITA’ SPONTANEA (MOTORIA) GENERALE: l’animale viene lasciato nella sua gabbia o nel suo ambiente (si intende tipi di movimenti, fame, sete, etc..) REATTIVITA’ GENERALE: comportamento che l’animale esibisce quando viene posto in ambienti che non gli sono abituali In ambienti non abituali, tutti gli animali hanno una reazione che può essere di inibizione parziale o totale dell’attività o viceversa di eccessiva reattività. Per evitare che ciò possa interferire con lo studio si lascia sempre l’animale nell’ambiente o nello strumento (periodo di adattamento). Tali studi prevedono lo studio:

Tamburo ruotante Strumento per misurare l’attività motoria generale. Viene misurato il numero di giri effettuati che dà l’indicazione dell’attività motoria dell’animale

Rotarod methos (metodo di coordinazione motoria) Si valuta la capacità di topi di restare su di un bastone rotante Animali che non cadono entro 3 min sono utilizzati per gli esperimenti

Rotarod methos (metodo di coordinazione motoria) Si valutano il numero di topi caduti o il tempo impiegato per cadere

Activity cage Misura la “curiosità” che ha l’animale di esplorare l’ambiente circostante.

Hole-board test (tavola a buchi) Valutazione dell’attitudine del topo all’esplorazione (“grado di curiosità”) Si utilizza un struttura che presenta numerosi buchi in cui l’animale può infilare il naso

Hole-board test (tavola a buchi) Si valutano in numero di volte che l’animale introduce la testa nei buchi in 60 sec. Il farmaco da testare ad attivata centrale potrà ridurre o aumentare tale numero: Se aumentano attività disinibente (ansiolitico) Se diminuiscono attività pro-inibente (ansiogeno) MODIFICHE: Si può valutare il tempo di esplorazione

Labirinto ad Y Si basa sul comportamento di “alternanza” che caratterizza l’attività esplorativa In questo tipo di labirinto, il ratto (o topo) percorre prima un braccio e poi l’altro senza ripetere l’entrata nel braccio visitato la prima volta. Nell’unità di tempo (3-5 minuti) si contano il numero delle entrate e l’alternanza nei 2 bracci della Y. Un ratto in condizioni normali alterna mediamente 4-6 volte nei 2 bracci. TEST USATO ANCHE NELL’ ALZHEIMER

Modelli di memoria ed apprendimento Passive and Active avoidance test Per testare farmaci ipnotici-sedativi e farmaci per la memoria (morbo di Alzheimer)

Passive Avoidance Test Ratti/Topi che passano da un compartimento illuminato ad uno oscuro dove ricevono scosse elettriche Gli animali imparano “l’esperienza” 24h prima dell’esperimento

Passive Avoidance Test VALUTAZIONE: Tempo impiegato per l’attraversamento lucebuio (cut off 300 sec) Test utile per valutare F che influenzano la memoria; è un modello per valutare l’ansia da stati conflittuali

Active Avoidance Test I ratti sono posti nella “Shuttle Box”. Una gabbia bipartita col pavimento basculante, costituito da una griglia metallica, collegata con un generatore di shock temporizzato.

Active Avoidance Test L’arrivo della scossa (1.5 mA) al pavimento è preceduto di 5 sec da uno stimolo sonoro e/o acustico L’accensione della luce o il suono rappresentano lo STIMOLO CONDIZIONANTE (CS), la scossa elettrica è lo stimolo incondizionato (US). L’animale riceve lo CS e subito prima dell’US fugge dalla parte opposta della gabbia

Si effettuano sedute giornaliere (30 stimoli/die) per 5 giorni e l’animale “impara” a fuggire nella parte opposta della gabbia immediatamente dopo lo CS (fase di apprendimento) Questo test è detto attivo proprio perchè l’animale deve dare una risposta motoria di evitamento

FINE