Aromatic compounds are found in all organisms in the form of aromatic amino acids and are profusely produced by plants as soluble secondary products (such as phenols and flavonoids) and as the polymer lignin. In addition, common environmental aromatic pollutants such as BTEX (benzene, toluene, ethylbenzene and xylene) are derived from petroleum. Microorganisms collect a diversity of aromatic compounds and transform them via peripheral (upper) pathways into a few key central intermediates such as catechol, protocatechuate and benzoyl-CoA. Central (lower) pathways then cleave the aromatic ring and convert the central intermediates into intermediary metabolites such as acetyl-CoA, succinyl-CoA and pyruvate, which can be used for microbial growth

Reazioni di ossigenazione nella biodegradazione dei composti aromatici diossigenasi idrossilanti intradiolo diossigenasi O2O2 extradiolo diossigenasi O2O2

Ciclo di ossidazione dei composti aromatici

Diossigenasi Idrossilanti Bertini, Cremonini, Ferretti, Lozzi, Luchinat, Viezzoli Coord.Chem.Rev ISP: iron-sulfur protein

monomeri Multimero (  3  3 ) PM: 200’000 EteroMultimeri (  n  n ) OmoMulti meri (  n ) Gibson & Parales Curr.Op.Biotech. 2000

Naftalene diossigenasi

Indolo Naftalene Naftalene cis-diidrodiolo Karlsson et al. Science 2003

2 enantiomeri 2 regioisomeri 2NTDO = 2-nitrotoluene diossigenasi

Ring-cleaving diossigenasi protocatecuato gentisato semialdeide  -idrossi-  - carbossi muconica acido  -carbossi- cis,cis muconico semialdeide  -idrossi-  - carbossi muconica 2,3 PCD 3,4 PCD 1,2 GTD O2O2 1,2 PCD O2O2 O2O2 O2O2 acido maleil piruvico

Posizione centrale di PCA e GTA nei pathways di degradazione degli aromatici

Schema dei siti metallici in intra- e extra- diolo diossigenasi III II intra-diolo protocatecuato 3,4 diossigenasi (3,4 PCB) extra-diolo 2,3diidrossi-bifenile 1,2-diossigenasi (BphC) Leganti che stabilizzano il ferro(II) rispetto al ferro(III) (Tyr)-O -  (Asp)-O - (Glu)-O -  His-N  (Cys)-S - Fe(II) Fe(III) Siti di coordinazione liberi o occupati da molecole di solvente e disponibili per legare O 2 e substrato

Proprietà molecolari di intradiolo diossigenasi

Struttura di 3,4 PCD da P.aeruginosa Le 12 subunità  sono disposte ai 4 vertici di un tetraedro. Le subunità  formano la struttura centrale dell’enzima e determinano la stabilizzazione della struttura quaternaria Fe 3+ è situato all’interfaccia tra le subunità  e . E’ coordinato a 4 residui appartenenti alla subunità  (Tyr-108, Tyr-147, His-160 e His-162) e giace in una tasca formata da un lato da residui della subunità  e dall’altro della . Residui della subunità , che si affacciano sul Fe 3+, contribuiscono ad orientare correttamente il substrato. Sono la Pro-15 (orienta anello aromatico) e l’Arg-133 (stabilizza il COO - )

EPR in presenza di substrato con 17 O sugli OH indica il legame del substrato con entrambi gli OH. Non si osserva invece variazioni se al complesso si aggiunge H 2 O arricchita con 17 O, indicando che l’acqua viene allontanata. Dati EXAFS indicano la presenza di 5 leganti (N/O) a distanza media di 1.99 Å. Allargamento iperfine del segnale EPR (g=4.28) in presenza del substrato

Ipotesi sul legame del substrato alla protocatecuato 3,4 diossigenasi

Meccanismo di rottura intradiolica catalizzata da Fe(III) diossigenasi R R R R R

Schema completo (sulla base di calcoli DFT alcune alternative sono possibili per il riarrangiamento dell’intermedio h fino al prodotto m)

Proprietà molecolari di extradiolo diossigenasi Meno stabili delle intradiolo. Per la purificazione è necessario introdurre stabilizzanti che impediscono la perdita del Fe(II) (cys, solventi organici, Fe 2+ ). Esposizione a ossidanti disattivano l’enzima

The enzyme consists of two domains which share the same fold; each domain contains two ß  ßßß repeats. The three iron ligand residues are provided by the C­terminal domain. Note that the protein binds two iron atoms: an active site iron buried in the domain B and an adventitious iron present with partial occupancy and is derived from the crystal stabilising solution Struttura di 2,3 diidrossibifenile 1,2 diossigenasi

Geometria di coordinazione del ferro

Ipotesi sul legame del substrato a extra-diolo diossigenasi EXAFS indica presenza di 2 His nel sito di coordinazione del Fe 2+ Possibili leganti del Fe 2+ 2 His, H 2 O / Glu (non ci sono evidenze spettroscopiche) Da X-ray di 2,3 diidrossibifenile 1,2 diossigenasi (BphC)

Meccanismo di rottura extradiolica catalizzata da Fe(II) diossigenasi

Confronto tra intra- ed extra-diolo diossigenasi INTRA- Fe 3+ (acido di Lewis) attiva il substrato per l’attacco nucleofilo su O 2. Il substrato può cambiare tipo di coordinazione (da bidentato a monodentato) in seguito al legame dell’O 2. EXTRA- Fe 2+ può essere sostituito da Mn 2+. Il suo ruolo è quello di orientar e correttamente i due reagenti e di modificarne le configurazioni elettroniche. Il substrato non cambia tipo di coordinazione in seguito al legame dell’O 2 sul Fe 2+.

Schema della degradazione di un idrocarburo alifatico saturo a catena lineare (n-alcano) mediante ossidazione del gruppo metilico terminale

Ciclo di ossidazione dei composti aromatici TOL pathway

Schema generale della degradazione di composti aromatici

Modalità di apertura dell’anello aromatico del catecolo. Le due vie in meta sono usate anche in funzione della presenza di sostituenti sull’anello

Modalità di apertura dell’anello aromatico di composti diidrossilati diversi dal catecolo.

Un esempio di via periferica che porta alla formazione di catecolo.

Le possibili vie periferiche per la degradazione del toluene

Degradazione dello stirene A: attacco iniziale di una monossigenasi sul vinile B: attacco iniziale di una diossigenasi sull’anello

Diverse vie per la degradazione degli xileni Orto-xylene: è preferito attacco sull’anello Meta- e para-xylene: è preferita la via TOL Il simbolo indica l’arresto del processo di biodegradazione

Biodegradazione del trimetil benzene attraverso la via TOL (A). In B la via TOL porta a un intermedio non ulteriormente biodegradabile

The aerobic degradation of benzoate in bacteria and fungi is shown here as an example of a classical O 2 - dependent strategy for aromatic-ring cleavage. Fungi convert benzoate mainly to protocatechuate, by mono- and dioxygenases, whereas most bacteria form catechol. Central- pathway ring-cleaving dioxygenases cleave the ring either between the two hydroxyl groups (ortho-cleavage, seen in the β-ketoadipate pathway) or next to one of the hydroxyl groups (meta-cleavage).

Pathways of aromatic compounds degradation OH

Degradazione di naftalene e antracene

Regolazione (negativa) della degradazione del bifenile in Pseudomonas KKS102 HOPDA Gli enzimi sono espressi debolmente in assenza di bifenile Gene, Volume 256, 2000, Pages Y. Ohtsubo et al.

Regolazione della degradazione del bifenile in P. pseudoalcaligenes KF707: due regolatori 1 2 La regolazione di BphR2 non è nota