IL PROCESSO ANALITICO Controllo di Qualità Fase Pre-analitica Fase Post-analitica

Variabilità della fase preanalitica La fase preanalitica, diversamente da quella analitica, non è di regola sottoposta a validazione dei metodi nè a controllo di qualità: i fattori di variabilità in questa fase sono quindi particolarmente difficili da controllare. La fase preanalitica riguarda tre momenti del ciclo analitico: La raccolta del campione, Il suo trasporto in laboratorio La sua conservazione e preparazione prima dell’analisi

Campioni di sangue Il campione di sangue può essere ottenuto per: Puntura venosa (sangue venoso) Per puntura arteriosa (sangue arterioso) Per puntura cutanea (sangue capillare, arteriolare,) Sangue venoso è quello che va dalla periferia al cuore e trasporta anidride carbonica mentre quello arterioso è quello che trasporta ossigeno

Campioni di sangue Il sangue intero: si ottiene prelevando sangue con anticoagulanti senza sottoporlo a sedimentazione o centrifugazione.Esso contiene la componente corpuscolata (eritrociti, leucociti, piastrine) e la componente acquosa con i soluti disciolti. Il plasma si ottiene da sangue intero prelevato con anticoagulante, separandolo dagli elementi corpuscolati mediante centrifugazione. Contiene per il 90% acqua e per il 10% i soluti disciolti (proteine, metaboliti, elettroliti, minerali, ormoni, ecc.). Il siero si ottiene dal sangue intero senza aggiunta di anticoagulanti. Esso, quindi, è privo di fibrinogeno. sangue intero essicato su carta: si ottiene adsorbendo il sangue su apposita carta da filtro e lasciandola asciugare a temperatura ambiente. Il campione cosi raccolto è stabile e può essere utilizzato per molte procedure analitiche ( ormoni,analisi del DNA, metaboliti vari,) Dal prelievo di sangue, si possono ottenere 3 diversi tipi di campioni il plasma si ottiene per centrifugazione da un campione di sangue intero a cui è stato aggiunto un anticoagulante (per esempio, citrato, eparina) immediatamente dopo il prelievo. Il plasma può essere congelato per successive analisi. Il siero ha una composizione simile a quella del plasma, ma non contiene i fattori di coagulazione, poichè si ottiene lasciando coagulare il campione di sangue prima della centrifugazione. Per i test della coagulazione tutti i fattori coinvolti nella coagulazione devono essere preservati, quindi il siero non può essere utilizzato. Bisogna sottolineare che rispetto al siero il plasma ha emolisi inferiore. Il non corretto utilizzo degli anticoagulanti è una delle più frequenti cause di errore preanalitico

Se si raccoglie il sangue in una provetta che non contiene anticoagulanti, e si permette la formazione del coagulo, si può ottenere, dopo centrifugazione, un campione di siero. siero plasma coagulo Se il sangue è raccolto in una provetta contenente un anticoagulante, ed es. eparina, dopo centrifugazione il supernatante è costituito da plasma.

IL PRELIEVO La procedura di prelievo costituisce una delle cause più importanti e frequenti di variabilità preanalitica. E’ molto importante la la scelta del sito di puntura, del mezzo di prelievo e dell’eventuale anticoagulante. Di importanza preminente è la tecnica del prelievo e la capacità del prelevatore.

Metodo di prelievo Bisogna eseguire il prelievo di sangue venoso evitando una eccessiva stasi venosa da laccio emostatico che può indurre fenomeni di emoconcentrazione

Metodo di prelievo Un altro frequente errore è quello di far stringere ed aprire il pugno al paziente a laccio serrato: L’esercizio muscolare in condizioni anaerobiche può comportare un aumento di potassio, fosforo e lattato. Altri errori riguardano l’uso di un ago di calibro troppo esiguo, l’applicazione di una eccessiva depressione alla siringa, le punture ripetute nello stesso sito.

Metodo di prelievo Un prelievo mal eseguito presenta spesso tracce di emolisi. E’ un fenomeno che si presenta nel 3-4 % dei casi ed è la causa più frequente di inadeguatezza qualitativa del prelievo di sangue (60% dei campioni non processati) Conseguenza dell’emolisi è il passaggio nel siero o nel plasma dell’emoglobina e delle sostanze contenute nei globuli rossi.

EMOLISI

Principali cause di emolisi Emolisi osmotica: presenza di acqua, alcool o altri solventi nell’ago, nella siringa o nelle provette Emolisi meccanica: impiego di aghi da prelievo troppo sottili; eccessiva aspirazione durante il prelievo di sangue o pressione troppo elevata durante l’espulsione del sangue dalla siringa quando non si toglie l’ago; agitazione troppo vigorosa della provetta Emolisi fisica: conservazione prolungata del campione di sangue in condizioni di temperatura non idonee; va evitato il congelamento perché la cristallizzazione dell’acqua endoeritrocitaria provoca rottura delle membrane cellulari e lisi degli eritrociti

Emolisi Osmotica isotonica ipotonica ipertonica

Indagini biochimico cliniche: sangue intero, siero o plasma? Rispetto al siero il plasma ha emolisi inferiore Sangue intero: concentrazione endocitaria della sostanza è analoga a quella presente nel plasma (assenza di fenomeni di membrana) In alcuni casi la scelta è obbligata! Ad esempio: per le indagini ematologiche e chimico-cliniche di routine si utilizza preferibilmente il sangue venoso il sangue arterioso viene utilizzato per lo studio dei parametri dell’equilibrio acido-base

Il prelievo venoso È una tecnica che permette l’accesso alle vene attraverso un ago o un catetere, di solito è utilizzata per prelevare il sangue o per iniziare una infusione venosa È una procedura sterile fin quando la cute non è lesa Il sangue di un uomo corrisponde a circa l'8% del suo peso ed è formato da cellule, frammenti cellulari e da plasma (contenente varie sostanze organiche, il 7% di proteine el'1% di sali inorganici). La fase liquida del sangue coagulato è il SIERO e si distingue dal plasma per l'assenza di fibrinogeno ed altre proteine che intervengono nei processi di coagulazione. Per alcuni tipi di analisi è necessario impedire la coagulazione con l'aggiunta di anticoagulanti tipo eparina, EDTA, citrato di sodio, ossalato o fluoruro di sodio.

Preparazione del materiale Assicurarsi che tutto sia a portata di mano. cotone, laccio, sistema per provette sottovuoto (ago a doppia punta o ago Butterfly, camicia, provette), contenitori per l'eliminazione del materiale usato per il prelievo, supporti per provette. Materiale per il prelievo venoso EDTA: etilenDiamina-TetrAcetato Si usa per la sua capacità di chelare gli ioni bivalenti, la cui presenza facilita l’azione delle nucleasi, che degradano il DNA.

Inserimento dell’ago nella vena Allineare l’ago con la smussatura dell’ago verso l’alto Forare la cute con un angolo tra 15° e i 30 ° Diminuire l’angolatura fino a che l’ago sia parallelo con la cute, poi forare la vena Agitare delicatamente per favorire il mescolamento del sangue con l’anticoagulante (EDTA) 15 ° to 30 °

Completare la procedura Posizionare un tampone asciutto sul sito della venopuntura Rimuovere il laccio emostatico Estrarre l’ago Applicare una pressione immediatamente Alzare il braccio del pz Applicare un cerotto

Identificazione del paziente e delle provette Identificare il Paziente ed etichettare le provette Si raccomanda di fare sempre un controllo incrociato con etichette al momento del prelievo

Anticoagulanti L’impiego di anticoagulanti è indispensabile per la misura dei fattori della coagulazione nel plasma e per tutte le analisi su sangue intero, come l’esame emocromocitometrico e la velocità di eritrosedimentazione (VES).

Eparina E’ un mucopolisaccaride acido che esiste in commercio come sale di litio, di sodio o di potassio. E’ considerato l’anticoagulante naturale, in quanto è presente a bassi livelli nel sangue e nei tessuti. Agisce inibendo la trombina, in associazione con l’antitrombina III, e altri fattori della coagulazione. Altera la morfologia e la colorazione dei leucociti. Provoca aggregazione delle piastrine. E’ usata per i conteggi cellulari solo nelle specie in cui l’EDTA provoca emolisi

acido etilendiaminotetracetico EDTA acido etilendiaminotetracetico Rappresenta l’anticoagulante di scelta per l’esame emocitometrico E’ il migliore per studiare la morfologia delle cellule del sangue Esplica la sua azione anticoagulante sequestrando lo ione calcio, formando con esso dei sali insolubili Non altera il volume degli eritrociti Non provoca emolisi Riduce al minimo la lisi dei leucociti Limita l’aggregazione piastrinica E’ rapidamente solubile nel sangue EDTA in eccesso raggrinzimento degli eritrociti

Citrato di sodio viene universalmente impiegato per la misura della VES, per lo studio dei fattori della coagulazione e della funzionalità piastrinica. Anche il citrato esplica la sua azione anticoagulante come l’EDTA

Le provette sterili monouso Sistema vacutainer a fondo emisferico Provette per campioni di sangue per esami specifici di biochimica

RACCOLTA DELLE URINE Campione di più semplice raccolta Recipiente pulito ed in alcuni casi sterile Esame completo delle urine: campione della prima minzione mattutina Rapido invio al laboratorio Modalità di raccolta e conservazione: mattutina, 24 h Precauzioni Modalità di raccolta per indagini microbiologiche

Esame fisico: colore e odore Il colore delle urine è spesso causato da farmaci, alcuni cibi o coloranti alimentari. In alcuni casi, per ò, i cambiamenti di colore delle urine possono essere causati da problemi di salute. Urine rosse o rosa: sangue, alimenti o farmaci Urine arancioni: farmaci o condizioni mediche Urine blu o verdi farmaci o condizioni mediche. Urine marroni:cibi. Farmaco e condizioni mediche Urine torbide :infezioni del tratto urinario

I contenitori per la raccolta delle urine Esame batteriologico delle urine: possono contenere sostanze che inibiscono la crescita batterica o acidi che stabilizzano alcuni metaboliti. Esame delle urine delle 24 ore: devono essere sufficientemente grandi per contenere una raccolta completa della urine Per l’esame biochimico delle urine è sufficiente raccogliere le urine di prima mattina in contenitori con tappo a vite

Campioni usati nelle analisi cliniche Il tipo di campione dipende dalle indagini da eseguire, in alcuni casi la scelta è obbligata. Sangue venoso, siero o plasma Sangue arterioso Sangue dai capillari Urine Feci Fluido cerebrospinale (LCS) Tessuto o cellule Calcoli Aspirato (fluido della pleura, asciti, fluido sinoviale, fluido intestinale…) Campioni “speciali” Per alcuni esami può essere richiesto l’uso di specifici fluidi corporei o tessuti. Ci sono protocolli specifici per maneggiare e trasportare questi campioni al laboratorio; sè necessario consultare il laboratorio locale per suggerimenti.

Liquido cefalorachidiano e puntura lombare Il liquor riempe tutti gli spazi liberi dall’encefalo e dal midollo spinale all’interno della dura madre Quantità: Adulto: 160 mL Neonato: 40/60mL Pressione liquorale: variabile da soggetto a soggetto ed è modificata in modo determinante dalla postura Aspetto: limpido e senza tracce di sangue è un fluido corporeo che si trova nel sistema nervoso centrale (SNC) e ha, tra le varie funzioni, quella di ridurre il peso dell'encefalo

Liquido cefalorachidiano e puntura lombare Il fluido cerebrospinale può essere analizzato per eseguire la diagnosi di una grande varietà di malattie neurologiche. Di solito viene estratto tramite una procedura chiamata puntura lombare ,che serve per contare il numero di cellule presenti nel fluido (oltre a rilevare quelle che non dovrebbero essere presenti, come i globuli rossi) e per misurare i livelli di proteine, glucosio e altre sostanze. Questi parametri da soli sono molto indicativi nella diagnosi di emorragia subaracnoidea e di infezioni del sistema nervoso centrale, come la meningite.

Puntura lombare Il liquor cerebrospinale viene raccolto con una puntura effettuata a livello della colonna vertebrale lombare Poiché l'estensione del midollo spinale finisce all'inizio della colonna lombare, la puntura non rischia di ferire strutture nervose. Campione: max 12-15 mL nell’adulto, da suddividere in più provette, sia per gli esami chimico clinici e sierologici, sia per gli esami microbiologici, sia per l’esame microscopico e citologico. Precauzioni: consegnare sollecitamente il campione al lab.; se necessario, conservare a 37°C, ma solo per un breve periodo di tempo.

Liquido sinoviale è un ultrafiltrato del sangue attraverso la membrana sinoviale È privo di proteine ad alto peso molecolare Indicazioni: indagini di laboratorio mirate ad approfondire e trattare le alterazioni delle articolazioni Quantità: Valori di riferimento nell’adulto: 3/3,5 ml infiammazioni: 25 ml Aspetto: limpido e senza tracce di sangue

Liquidi di versamento delle cavità sierose Le cavità sierose (pleurica, pericardica e peritoneale) contengono un fluido simile al siero per colore e caratteristiche chimico-fisiche, che si forma continuamente per ultrafiltrazione del plasma e viene riassorbito attraverso i capillari delle sierose, in modo che la quantità e la composizione restano costanti.

Prelievo a scopo terapeutico: per evitare la compressione degli organi endocavitari si effettua lo svuotamento per aspirazione mediante puntura cutanea Prelievo a scopo diagnostico: 50 mL divisi in provette diverse: con EDTA per analisi citologiche con eparina in contenitori sterili per esami microbiologici e colturali in vetro per esami di chimica clinica

Liquido amniotico L'amnios è un annesso embrionale che circonda e protegge l'embrione. Si forma principalmente per secrezione attiva da parte della membrana amniotica, delle vie respiratorie ed urinarie del feto, oltre che ad altri organi fetali. Poiché l'amnios è continuamente ricambiato, il suo riassorbimento avviene per mezzo dell’ apparato respiratorio del feto, per deglutizione o per intermediazione della membrana amniotica stessa. Aspetto: lievemente opalescente e di colore citrino molto tenue L’analisi del liquido amniotico consente di evidenziare: alterazioni cromosomiche (dopo la coltura degli amniociti) alterazioni genetiche (dopo la coltura degli amniociti ed estrazione del DNA) difetti strutturali (es., spina bifida, anencefalia) Anomalie metaboliche ereditarie Stato di maturità polmonare Paternità e sesso del nascituro

L’Amniocentesi È il prelievo transaddominale di 20-30 ml di liquido amniotico (con AGO 20-22G). Si esegue a partire dalla 14a settimana di gravidanza: se eseguita prima della XIV settimana aumenta il rischio di deformità fetali, di fallimento della procedura e di aborto (amnios e corion non sono ancora fusi). Comporta un rischio di aborto dell'1%, dipendente dalla manualità dell'operatore Precauzioni: per le analisi citogenetiche o biochimiche è necessario usare provette sterili di materiale plastico per evitare che le cellule aderiscano alle pareti e non siano più recuperabili.

Feci Per ottenere un campione affidabile è importante seguire le istruzioni precise: Indicazioni dietetiche e comportamentali per il periodo precedente la raccolta Istruzioni per la raccolta vera e propria del campione Quelle per il suo trasporto in laboratorio

Feci Indagini: Ricerca del sangue occulto Ricerca di parassiti e/o loro uova Presenza di enzimi e/o sostanze parzialmente digerite

La ricerca del sangue occulto indicatore precoce della presenza di polipi o tumore del colon. Caratteristiche: test qualitativo, colorimetrico Modalità di raccolta del campione: il paziente raccoglie con una spatolina una piccola porzione di feci e le depone su un cartoncino. Precauzioni: Falsi positivi: ogni sorgente di sangue darà un risultato positivo, quindi il sangue proveniente da emorroidi sanguinanti, ragadi anali e il sangue mestruale interferirà con il test. Falsi negativi: causati dall’incostante sanguinamento dei polipi, quindi il paziente avrà cura di ripetere la raccolta del campione per tre giorni consecutivi. Inoltre, nei giorni che precedono il test non bisogna assumere Vitamina C, in quanto essa può interferire con la reazione del test, convertendo un risultato positivo in falsamente negativo.

La ricerca del sangue occulto Il test del sangue occulto fecale (SOF), ha lo scopo di rilevare la perdita sottile di sangue nel tratto gastrointestinale, inteso come il tratto che va dalla bocca al colon. Un test positivo ("SOF positivo") può derivare da un sanguinamento del tratto gastrointestinale superiore od inferiore. Un simile risultato richiede ulteriori approfondimenti diagnostici al fine di rilevare una eventuale ulcera peptica o neoplasia (ad esempio cancro del colon-retto o cancro dello stomaco). Il test non ha una specificità tale da rilevare direttamente un cancro del colon, ma è spesso usato in clinica lo screening di tale malattia. Il test può anche essere utilizzato per ricercare la perdita attiva di sangue occulto che porta ad una anemia o quando ci sono sintomi gastrointestinali da approfondire.

Errori di campionamento In molti casi possono invalidare i risultati! Tecnica di prelievo del sangue Stasi prolungata durante la venopuntura Campione insufficiente Errori nel campionamento a tempo Contenitore sbagliato del campione Sito inappropriato di prelievo Conservazione sbagliata del campione

Caso clinico Un campione di sangue viene prelevato da una donna di 65 anni per valutare la concentrazione di Na e K nel siero, poichè essa è in trattamento con diuretici da un pò di tempo.

Caso clinico ....il medico dimentica il prelievo in macchina e lo trasporta al laboratorio la mattina successiva. Immediatamente dopo aver analizzato il campione il laboratorio contatta il medico. Perchè?

Caso clinico I risultati degli esami indicano che: Sodio=120 mmoli/l (135-146 mmoli/l) Potassio= 6.7 mmoli/l ( 3.5-5.2 mmoli/l) Iponatriemia e iperkaliemia? Malattia endocrina (morbo di Addison)?

Caso clinico Nel caso di un ritardo nella separazione del siero dal coagulo, le concentrazioni di sodio e potassio non sono attendibili dal momento che questi ioni entrano ed escono dagli eritrociti secondo i loro gradienti di concentrazione. E’ necessario un altro prelievo di sangue per stabilire lo stato reale degli elettroliti di questa paziente

Trasporto del campione biologico al laboratorio E’ molto importante che i tempi non siano eccessivi perché influenzano la stabilità del materiale e quindi l’accuratezza della misura In generale, dal momento in cui si effettua il prelievo è importante eseguire: immediatamente i test su fattori della coagulazione la centrifugazione entro 1 h l’esame emocromocitometrico entro 7 h La VES non oltre 24 h dal prelievo

Trasporto del campione biologico a distanza I contenitori impiegati per la spedizione devono essere di dimensioni idonee, infrangibili e muniti di tappi a tenuta sicura Durante il trasporto vanno evitate eccessive vibrazioni per i loro effetti dannosi sui fattori della coagulazione e sugli elementi figurati del sangue. Se il campione esige una conservazione a bassa temperatura è indispensabile l’aggiunta di ghiaccio sintetico o secco o azoto liquido nella spedizione, in modo da mantenere il campione alla temperatura prevista per il tempo necessario al trasporto

Interpretazione dei risultati Come vengono espressi i risultati biochimici Variabilità nei risultati Accuratezza , precisione, sensibilitaà Valori di riferimento