Sintesi chimica del DNA

Sintesi in fase solida di oligonucleotidi Per la sintesi vengono utilizzati fosforamidi dei vari nucleotidi. La fosforamide contiene un buon gruppo uscente che promuove la reazione di formazione di un legame fosfoestere (fosfito). Il monomero attivato aggiunto contiene dimetossitritile (DMT) che protegge il 5’ OH e un gruppo β-cianoetilico di protezione del gruppo ossidrilico 3’. Dopo la sintesi i legami fosfoestere vengono ossidati da fosfiti a fosfati

Sequenziamento

Sequenziamento con idrolisi chimica (Maxam and Gilbert 1977) (formic acid) Uso di reagenti chimici che alterano una o al massimo due basi. La base alterata viene essere rimossa (attraverso riscaldamento) e una seconda reazione con piperidina porta alla rottura della catena polinucleotidica nel sito abasico I vari frammenti ottenuti dopo l’idrolisi nelle diverse condizioni sono separati su gel Le molecole di DNA, sottoposte alIe differenti reazioni chimiche e specifiche per le varie basi, sono marcate ad una estremità. Questo permette di visualizzare solo i frammenti che iniziano con l’estremità marcata e terminano con il sito di taglio e la misura loro lunghezza identifica la posizione della base che è stata alterata nella specifica reazione

Lettura della sequenza di DNA Esempio dei frammenti, contenenti l’estremità marcata, ottenibili con l’idrolisi chimica specifica per la guanina di una molecola di DNA

Principio della tecnica Sequenziamento chain-terminator o metodo con dideoxinucleotidi (Sanger, 1977) Metodo enzimatico che richiede l’uso di una DNA-polimerasi e specifici primer La reazione è condotta in presenza di paricolari nucleotidi,ididesossinucleotidi, che se incorporati portano alla prematura terminazione della sintesi del DNA perchè privi del 3’OH Principio della tecnica 3’ T T T T 5’ 5’ primer 3’ Nella reazione oltre al dATP è presente anche il ddATP (in genere in rapporto 1:10). Quando occasionalmente viene incorporato il ddATP la reazione di polimerizzazione si interrompe e la lunghezza del frammento mi fornisce la posizione della base usata come ddNTP ddA ddA ddA ddA

Le molecole di DNA da sequenziare vengono sottoposte a quattro differenti reazioni, in ognuna delle quali è presente un ddNTP. Le reazioni di sintesi del DNA vengono innescate da uno stesso prime opportunamente marcato per permettere la migliore visualizzazione dei frammenti prodotti. I frammenti prodotti durante la sintesi vengono successivamente separati su gel e, anche in questo caso, la misura loro lunghezza identifica la posizione della base che è stata utilizzata come ddNTP nella reazione di polimerizzazione.

Lettura della sequenza di DNA

Sequenziamento automatico Nelle quattro differenti reazioni di polimerizzazione, oltre che essere utilizzati differenti ddNTP, la sintesi del DNA viene innescata dallo stesso primer ma marcato con quattro fluorofori differenti. Questo permette di distingure i frammenti che sono terminati dal ddATP o da un altro ddNTP perché hanno una fluorescenza differente. I prodotti delle quattro reazioni vengono riuniti e analizzati sullo stesso gel. La separazione elettroforetica permetterà di distinguere i vari frammenti in base alle dimensioni e lo specifico colore di fluorescenza indicherà la base che si trovava in quella posizione.

Sequenziamento automatico I prodotti delle quattro reazioni vengono riuniti e separati in continua su gel o elettroforesi capillare. Un rivelatore è posto alla fine del ge,l o del capillare, e analizza l’intensità ed il colore del frammento che viaggia nel gel, permettendo cosi di avere informazioni sul tipo di base presente al termine di quel frammento. Il risultato è una serie di picchi consecutivi, che rappresentano i vari frammenti eluiti a dimensioni crescenti (ognuno è più lungo di una base) ed il colore identifica la base terminale (permettendo di leggere direttamente la sequenza del frammento).

La PCR

La Polymerase Chain Reaction o PCR Replicazione in vitro di determinati tratti di DNA, selezionati tramite specifici primers Come funziona? Miscela di reazione 5’ 3’ d.NTPs Thermal Stable DNA Polymerase Primers Ripetizione del ciclo Denaturazione 95°C 3’ 5’ Taq 5’ 5’ 3’ Estensione 5’ 3’ Taq Annealing 50-65°C Estensione 72°C 5’ 3’

La PCR (il primo ciclo)

La PCR (secondo ciclo)

But of course, the reaction can’t go on forever, and it eventually tails off and reaches a plateau phase, as shown by the figures in red. If we plot these figures in the standard fashion (top), we cannot detect the amplification in the earlier cycles because the changes do not show up on this scale. Eventually you see the last few cycles of the linear phase (pink) as they rise above baseline and then the non-linear or plateau phase (red) - in real life this starts somewhat earlier than shown here. If we plot the amount of DNA on a logarithmic scale, we can see the small differences at earlier cycles - in real time PCR we use both types of graph to examine the data. Note that there is a straight line relationship between the amount of DNA and cycle number when you look on a logarithmic scale - because PCR amplification is a logarithmic reaction.

Applicazioni della PCR Amplificazione selettiva di specifiche regioni di DNA (la sequenza di DNA amplificato è delimitata dai primers e la loro specificità determina la qualità dell’amplificazione Indicazioni sulla presenza di specifiche sequenze di DNA in un campione. Se presenti verranno amplificate e quindi rivelabili tramite elettroforesi altrimenti possono essere considerate assenti. In campo diagnostico permette di determinare infezioni virali (esempio retrovirus o virus difficili da diagnosticare), altri patogeni, presenza di DNA estraneo, ecc. Clonaggio di sequenze informazionali (geni o altre regioni di DNA), a patto di conoscere le sequenze delle regioni limitrofe (inizio e fine) per costruire specifici primers. Genotipizzazione (DNA fingerprinting)

Genotipizzazione tramite PCR

ANALISI DELLE STR Le STR (Short Tandem Repeats) sono sequenze di 2-6 bp ripetute da 3 a 50 volte che si trovano all’interno di regioni introniche Sono note anche come DNA microsatellite o simple sequence repeats (SSRs) Techniques       RFLPs are used to identify, localize and track gene markers by comparing restriction maps of different individuals. Restriction maps represent a linear sequence of DNA obtained by identifying points of breakage within the DNA. Targets for specific breaks are determined by restriction enzymes. Each restriction enzyme has a particular target in double-stranded DNA, usually a short specific sequence of 4 to 6 base pairs. The fragments of DNA can be separated on the basis of their size by gel electrophoresis. In this technique, fragmented DNA is placed on the top of an agarose or polyacrylamide gel and moved via an electric current, which passes through the gel. Each fragment moves through the gel at a rate that is inversely related to the log of its molecular weight [1]. As a result, the movement produces a series of bands, which correspond to each particular size of fragment. A difference of banning patterns among individuals (RFLPs) can be used as a genetic marker by directly examining the genotype (Fig. 4). The identification of such a marker offers a diagnostic procedure for detecting disease and may lead to isolation of a particular gene.       The existence of RFLPs allows individuals to be identified according to their unique banning patterns. DNA fingerprinting involves the use of DNA restriction analysis for the detection of individual-specific patterns, which is based on highly polymorphic sequences.[2] Genetic fingerprinting is most commonly associated with criminal and civil law, but may also be used to establish unambiguous parent-progeny relationships in cases where parentage is in doubt. Le STR possono essere amplificate mediante PCR La regione ripetuta è di lunghezza variabile mentre le regioni adiacenti, dove si legano i primers, sono costanti Gli individui possono essere omozigoti (i due alleli hanno la stessa lunghezza) o eterozigoti (i due alleli hanno lunghezze diverse)

Amplificazione di una STR 195 bp 170 bp TCAT repeat unit

Frequenza allelica nelle STR 5 10 15 20 25 30 35 40 45 6 7 8 9 9.3 TH01 Marker Number of repeats Frequency Caucasians (N=427) Blacks (N=414) Hispanics (N=414) *Proc. Int. Sym. Hum. ID (Promega) 1997, p. 34

FBI’s CODIS DNA Database

13 CODIS Core STR Loci with Chromosomal Positions Loci STR del CODIS TPOX D3S1358 TH01 D8S1179 D5S818 VWA FGA D7S820 CSF1PO AMEL D13S317 AMEL D16S539 D18S51 D21S11 13 CODIS Core STR Loci with Chromosomal Positions

Analisi comparativa delle STR Amplificazione contemporanea di più STR mediante Multiplex PCR Ridotta probabilità di errori introdotti con la PCR (Informazione nella lunghezza e non nella sequenza) Risultati uniformi Possibilità di analizzare campioni in tracce Analisi mediante DNA-PAGE o elettroforesi capillare Rapidità nella separazione Comparazione e/o identificazione L’analisi comparativa di 13 STR permette di ridurre la probabilità di un random match fino a 1 su 1012 Disponibilità di kit commerciali e apparecchiature dedicate

Human identity testing • Casi forensici – analisi comparative tra sospettati e prove • Test di paternità/maternità – identificazione padre/madre • Studi storici • Studi su persone scomparse • Disastri di massa – identificazione • Military DNA “dog tag” (alternativa alla piastrina) • Creazione di DNA databases relativi a criminali condannati

Campioni analizzabili • Sangue • Liquido seminale • Saliva • Urine • Capelli • Denti • Ossa • Tessuti

Procedura di analisi

AmpFlSTR® Profiler Plus™ Esempio di un Forensic STR Multiplex Kit AmpFlSTR® Profiler Plus™ Kit available from PE Biosystems (Foster City, CA) D3 FGA vWA 5-FAM (blue) D13 D5 D7 NED (yellow) A D8 D21 D18 JOE (green) GS500-internal lane standard ROX (red) 100 bp 400 bp 300 bp 200 bp Size Separation Color Separation 9 STRs amplified along with sex-typing marker amelogenin in a single PCR reaction

Human Identity Testing con Multiplex STRs Simultaneous Analysis of 10 STRs and Gender ID AmpFlSTR® SGM Plus™ kit Two different individuals DNA Size (base pairs) amelogenin D19 D3 D8 TH01 VWA D21 FGA D16 D18 D2 Results obtained in less than 5 hours with a spot of blood the size of a pinhead probability of a random match: ~1 in 3 trillion

PCR quantitativa

Amplificazione e quantificazione di specifici frammenti di DNA Amplificazione attraverso l’uso della Polymerase Chain Reaction o PCR (reazione a catena della polimerasi) Quantificazione in tempo reale del DNA amplificato mediante l’uso di sonde fluorescenti (molecole in grado di assorbire la luce e riemetterla ad un determinato colore) L’insieme di queste due tecniche prende il nome di Real-time PCR

Prodotto (T) = (DNA iniziale) x 2n Limite della PCR In teoria la quantità di DNA amplificato raddoppia ad ogni ciclo e il suo quantitativo può essere espresso dalla formula Prodotto (T) = (DNA iniziale) x 2n (n = numero di cicli) In realtà dopo un certo numero di cicli la quantità di DNA non aumenta più esponenzialmente (consumo dei substrati, ovvero I precursori per costruire le catene di DNA, e inattivazione dell’enzima) Teorico Reale DNA amplificato (scala log) Numero di cicli

Campioni con diverso contenuto iniziale dello stesso DNA e sottoposti ad amplificazione mediante PCR seguiranno delle cinetiche di amplificazione differenti 4 unità 1 unità 1/8 di unità

Determinazione del quantitativo di DNA amplificato SYBR Green I

Il SYBR Green I agente fluorescente intercalante Estensione 5’ 3’ Lettura della fluorescenza Taq ID l

Come sono quantificati i dati raccolti dallo strumento? Reale Teorico threshold DNA amplificato (scala log) Detector Una volta determinata la linea di base (fluorescenza nei primi cicli di amplificazione), la linea di threshold viene scelta come il valore di fluorescenza che statisticamente supera la linea di base (10 volte la deviazione standard della linea di base). Numero di ciclo

Ct : threshold cycle E’ il ciclo al quale la fluorescenza relativa al DNA amplificato supera il valore della linea di threshold. Il Ct è proporzionale al numero di sequenze di DNA iniziali amplificate con la PCR.

Il Ct è proporzionale al numero di sequenze di DNA iniziali amplificate con la PCR. 4 unità Ct =23 1 unità Ct = 25 1/8 di unità Ct = 28 4 units Ct=23 1 unit Ct=25 1/8 unit Ct=28 Valori di Ct 25 23 28

Ct : threshold cycle L’uso di curve di taratura permette anche di determinare il valore assoluto di specifiche sequenze di DNA nel campione analizzato.

Che cosa è la Real-time PCR? Si basa sulla determinazione quantitativa e in tempo reale dei prodotti di amplificazione della PCR mediante l’uso di molecole fluorescenti che si legano al DNA La Real-time PCR permette di quantificare i livelli di una specifica molecola di DNA misurando il numero di cicli (Ct) necessari per ottenere un quantitativo di prodotto amplificato superiore ad un determinato livello (threshold) What is real time qPCR? It is fluorescence-based detection of amplification products through the use of a DNA-binding dye or probe chemistry. In a qPCR assay one measures the input level of a nucleic acid by determining the number of cycles required to reach a set level of product. This is in contrast to traditional PCR where end-point analysis is performed for product distinction.

Applicazioni della Real-time PCR Quantificazione precisa di DNA o RNA in campioni Stima del numero di copie di un gene (OGM) Studi di espressione genica RNA (quantificazione del mRNA)

Quantificazione dell’espressione genica Tutte le cellule di un organismo contengono lo stesso DNA (e quindi le stesse informazioni o geni). Tuttavia non tutti i geni vengono egualmente espressi (diversità tra cellule) Ogni gene espresso viene convertito in mRNA per poi essere tradotto in proteina Le differenti proteine prodotte in una cellula ne determinano le specifiche funzioni

E’ possibile quantificare i livelli di mRNA di specifici geni mediante la Real-time PCR L’mRNA viene prima convertito in DNA (cDNA) e poi sequenze specifiche (corrispondenti a determinati geni) vengono quantificate mediante la tecnica E’ così possibile identificare e quantificare geni che vengono diversamente espressi in determinate cellule o in seguito a modifiche (trasformazione tumorale)