Concomitant inhibition of AKT and autophagy is required for efficient cisplatin-induced apoptosis of metastatic skin carcinoma Sofie Claerhout1, Lien Verschooten1, Sofie Van Kelst1, Rita De Vos2, Charlotte Proby3, Patrizia Agostinis4 and Marjan Garmyn1

Cutaneous squamous cell carcinoma (cSCC) is one of the most common cancers in the Caucasian population and its incidence is still increasing worldwide,1,2 and is predicted to increase even further.3 Early SCC of the skin has a high curability and relatively low overall metastatic rate of 3–5%.4 However, certain tumor and patient characteristics predispose to the development of nodal disease and distant metastases,5 which portends a poor prognosis, with 5-year survival ranging from 14 to 39%, regardless of the treatment used.

Cisplatin is one of the best studied and currently most used (alone or in combination) chemotherapeuticum in the treatment of epithelial tumors, including SCC of the skin. Cisplatin causes DNA damage, interstrand and intrastrand DNA crosslinks, which is thought to induce cell death via apoptosis. Resistance to cisplatin has been shown to arise, due to several mechanisms including progressive acquisition of molecular changes downregulating proapoptotic pathways and activating survival pathways, including the PI3-K/AKT signaling cascade, as demonstrated in various non-SCC tumor

Activation of class IA phosphatidylinositol 3-kinases (PI3Ks) occurs through stimulation of receptor tyrosine kinases (RTKs) and the concomitant assembly of receptor–PI3K complexes. These complexes localize at the membrane where the p110 subunit of PI3K catalyses the conversion of PtdIns(4,5)P 2 (PIP 2 ) to PtdIns(3,4,5)P 3 (PIP 3 ). PIP 3 serves as a second messenger that helps to activate AKT. Through phosphorylation, activated AKT mediates the activation and inhibition of several targets, resulting in cellular growth, survival and proliferation through various mechanisms. Additionally, PI3K has been shown to regulate the activity of other cellular targets, such as the serum and glucocorticoid-inducible kinase (SGK), the small GTP- binding proteins RAC1 and CDC42, and protein kinase C (PKC), in an AKT-independent manner through poorly characterized mechanisms. The activity of these targets leads to survival, cytoskeletal rearrangement and transformation. GSK3, glycogen synthase kinase- 3 ; NF- B, nuclear factor of B; PDK1/2, 3-phosphoinositide- dependent protein kinase 1/2.

autofagia è il processo biologico che determina la degradazione di componenti della cellula stessa, siano essi macromolecole o organelli. In questo caso questi vengono circondati da vescicole derivanti dalla membrana del reticolo endoplasmatico portando alla formazione del cosiddetto autofagosoma. Successivamente questo si fonde col lisosoma che è quindi libero di riversarvi il proprio contenuto, formando l' autofagolisosoma.

Tra la vita e la morte L’Autofagia

Autophagy is a response to nutrient stress to maintain adequate internal levels of nutrients (self- -‐ cannibaliza8on). Role in cell death is best revealed if apoptosis is disabled (bax/bak--‐/--‐, caspase inhibitors, Bcl--‐xL++). In nutrient--‐poor condi8ons (or equivalent effects on mTOR signaling), autophagy maintains survival. In nutrient--‐rich condi8ons, autophagy promotes cell death in response to other types of stress.

Sopravvivenza o morte cellulare? Nella maggior parte delle circostanze, l’autofagia cos8tuisce un meccanismo di ada.amento allo stress Le modalità con cui l’autofagia si trasforma in un processo di morte cellulare non sono chiare – anche dopo estensiva auto--‐cannibalizzazione in assenza di fa.ori di crescita, le cellule possono recuperare se trasportate in condizioni adeguate Non ci sono evidenze che geni coinvol8 nel processo di autofagia siano implica8 in processi di morte cellulare fisiologica (es. sviluppo embrionale) – nematodi KO per bec--‐1, ortologo di ATG6/beclina 1 e topi KO per la beclina 1 hanno un numero maggiore di cellule apopto8che

Autophagy “eat oneself” Xenophagy “eat foreign maGer” Highly conserved and regulated process that maintains cellular homeostasis and protects cells against starvaKon and microbe invasion

3 Stages Iniation: nutrient starvation, growth factor--‐mediated starvation Execution Maturation

Cytoplasmic organelles and portions of cytoplasm sequestered in double membrane--‐ bound vacuoles Source of membrane multifactorial (ribosome--‐ free ER?) Fuse with lysosomes

Initiation:Signaling pathways Trimeric G proteins Growth receptors PI3K (classes I&III) protein phosphatases mTOR

Execution Requires covalent--‐conjugation pathways Requires Atg3, Atg7, Atg10 – Homologs of ubiquitinylation proteins – Modifies pathway components but does not target them for degradation Production of PIP3 via hVPS34 (class III PI3K) – Inhibited by wortmanin, 3--‐Methyladenine – Promotes proteolysis-- ‐>production of amino acids Complex formed between hVPS34, Atg14, & Atg6 (Beclin--‐1) which is necessary for downstream recruitment and localization of Atg5 & Atg12 Covalent linkage of Atg5 and Atg12 on pre--‐autophagosomal membrane Protease cleavage of Atg8 (MAP1 Light chain 3 (LC3), followed by covalent lipidation to phosphatidylethanolamine and translocation to autophagosome membrane

Fusion Autophagosomes fuse with endosomes Acquire characteristics of lysosomes– LAMP1&2 – Accessible to DAMP – Cathepsins, acid phosphatases Vesicle fusion mediated by Rabs (Rab24)

Involved in many processes ATG6/Beclin 1: tumour suppressor gene – Deleted in sporadic breast, ovarian, prostate CA Prevent premature senescence Host defense against pathogen invasion Autofagia ed omeostasi cellulare L’autofagia è coinvolta nella eliminazione di proteine danneggiate che se accumulate possono portare alla formazione di aggrega Eliminazione di organelli malfunzionan Mentre l’eliminazione di proteine può essere svolta anche da altri sistemi (proteasoma), l’autofagia è l’unico processo cellulare che può portare alla degradazione di interi organelli (mitocondri, perossisomi, ecc.)

Autofagia e malattie neurodegenerative Autofagosomi si accumulano nel cervello dei pazienti affetti da diverse malattie degenerative – inizialmente, l’autofagia ritenuta come un meccanismo patogene8co e scatenante la morte cellulare – attualmente, almeno nei modelli animali è chiaro che l’autofagia rappresenta un meccanismo di difesa e l’accumulo di autofagosomi una risposta fisiologica e di tentativo di clearance delle componenti cellulari danneggiate

Autofagia e cancro La dimostrazione che il gene per la beclina è perso in diversi tumori e quindi è un candidato oncosoppressore ha portato ad ipo8zzare che l’autofagia sia un meccanismo prevalentemente di difesa contro i tumori L’autofagia però può anche promuovere la sopravvivenza delle cellule tumorali in condizioni di stress (mancanza di nutrien8, tra.amen8 farmacologici)

Modelli animali di studio del rapporto fra autofagia e cancro Solo una copia di bec--‐1 (beclina) è persa nei tumori mammari Topi bec--‐1 +/--‐: diminuita autofagia, aumento della frequenza di diversi 8pi di tumori Due altri gene oncosoppressori (PTEN e p53) s8molano l’autofagia inibendo la funzione di TOR

L’autofagia è un processo cellulare che consente alle cellule di riciclare il proprio contenuto e di rimuovere in modo selettivo mitocondri e altri organelli danneggiati. Nelle cellule tumorali essa viene stimolata dalla chemioterapia e dalla radioterapia, ma non è chiaro se essa contribuisca alla morte delle cellule tumorali o piuttosto non consenta a esse di sopravvivere alle terapie anticancro. In uno studio in cui è stato utilizzato un modello murino del linfoma a cellule B, alcuni ricercatori del Dipartimento di medicina dell’Università della Pennsylvania hanno ora dimostrato che l’autofagia rappresenta in realtà proprio un meccanismo attraverso cui le cellule tumorali cercano di superare la sfida rappresentata dalle terapie che stimolano l’apoptosi, o morte cellulare programmata. In un articolo on line, pubblicato in anteprima rispetto alla sua uscita sul numero di febbraio della rivista Journal of Clinical Investigation, Craig Thompson e colleghi spiegano come in un tumore in cui era stata indotta l’apoptosi attraverso l’attivazione del gene p53, l’autofagia ha interessato unicamente quelle cellule tumorali che non sono andate incontro ad apoptosi. Quando l’organismo del topo non era in grado di iniziare l’autofagia, veniva rilevato un maggior numero di cellule tumorali che andava incontro ad apoptosi. Inoltre, se l’animale veniva trattato con farmaci antitumorali come la ciclofosfamide, aumentava l’apoptosi cellulare e la eventuale durata di remissone del tumore si allungava. Lo studio ha implicazioni cliniche e indica che l’affiancamento di inibitori dell’autofagia alle terapie standard potrebbe aumentare l’efficacia dell’induzione dell’apoptosi che queste determinano.