I trasposoni P, oltre che per la mutagenesi e l’inserimento di sequenze di interesse nel genoma di Drosophila, si sono rivelati utilissimi per molti altri scopi: identificare geni espressi in specifici tessuti (linee enhancer- trap) Studio delle regioni regolatrici di specifici geni

Vettore P (enhancer trap) reporter Un elemento enhancer-trap è un elemento P, che contiene un gene definito “reporter”, molto spesso si tratta del gene della  gal sotto il controllo di un promotore debole. Perché questo elemento abbia dei livelli di espressione accettabili è necessario che l’elemento si inserisca nel genoma in vicinanza di un enhancer di un gene endogeno. L’espressione del gene viene svelata con un substrato cromogeno (di solito Xgal-> 5-bromo4-cloro-indolyl-  -D-Galattopiranoside) Questo permetterà di identificare, nella zona in cui l’elemento si è inserito, un gene che è normalmente espresso nel tessuto o nello stadio in cui sarà possibile osservare la colorazione dovuta alla  gal e sarà inoltre possibile “recuperare” le sequenze fiancheggianti il sito di inserzione dell’elemento! O'Kane and Gehring 1987 enhancer Si sono ottenute + di 4000 linee trasformate “enhancer-trap” e sono state usate sia per la classica analisi fenotipica per cercare mutanti, qualora l’elemento si sia inserito all’interno di un gene codificante o per l’analisi di espressione, qualora l’elemento si sia inserito in vicinanza di un enhancer (Bier et al. 1989; Spradling et al. 1995).

TECNICA dell’ENHANCER TRAP Un enhancer trap contiene un promotore minimo, insufficiente di per sé, per indurre la trascrizione. Se, dopo la trasposizione, l’elemento si inserisce in una regione sotto l’influenza di un enhancer genomico, la sequenza inserita dovrebbe essere trascritta in maniera che rifletta l’attività dell’enhancer. Tecnica utilizzata per: 1)Identificazione di nuovi geni 2)Analisi dell’espressione di geni stadio/tessuto specifici  Gal expression pattern  Gal

PRODUZIONE DI DROSOPHILA TRANSGENICA con elemento P-lacZ

Ghiandole salivari Embrione -> identificazione de un gene dello sviluppo Identificazione di enhancer con l’uso di linee enhancer-trap

Linea  enhancer-trap  specifica  del testicolo

Linea  enhancer-trap  specifica  dell’ovario

P (Gal4) enhancer-trap technique La proteina Gal4 è una fattore di trascrizione di lievito che si lega in modo specifico a sequenze chiamate UAS e attiva la trascrizione di ciò che si trova a valle di queste sequenze! Il vettore P(Gal4) è un elemento P enhancer trap che, inserendosi in regioni in cui sono presenti degli enhancer produce la proteina Gal4 (e la  -Gal), in modo che si possa capire in quali tessuti sarà prodotta Gal4. (Brand and Perrimon, 1993; Kaiser, 1993)

(ad esempio questo enhancer potrebbe essere specifico dei tessuti germinali maschili (si potrebbe saggiare l’espressione del gene X proprio nei tessuti germinali maschili

Studio del PROMOTORE Drosophila puo’ essere un ottimo strumento per l’ANALISI del PROMOTORE: identificazione di regioni NECESSARIE per la funzione del Promotore Vengono prodotti MUTANTI di DELEZIONE fusi al gene LacZ Il gene ibrido viene clonato nell’elemento P e inserito nell’embrione per microiniezione L’attività della  galattosidasi permette di identificare la regione MINIMA del PROMOTORE e sequenze NECESSARIE alla sua regolazione

Analisi del PROMOTORE del gene DRONC: caspasi di Drosophila essenziale per apoptosi durante lo sviluppo embrionale del moscerino. Studio del PROMOTORE Distinct promoter regions regulate spatial and temporal expression of the Drosophila caspase dronc T J Daish, D Cakouros and S Kumar

embrione * * AEL -> After Egg Lying Il trascritto del gene dronc in condizioni normali è : altamente espresso negli embrioni, - altamente espresso negli embrioni, espresso nella camera uovo matura! - espresso nella camera uovo matura! - a bassi livelli nelle larve dal I al III STADIO - ad alti livelli nell ’ intestino e nelle ghiandole salivari - poco espresso nei dischi imaginali dell ’ occhio e nei lobi del cervello

cervello Il trascritto del gene dronc in condizioni normali è : - altamente espresso negli embrioni, - espresso nella camera uovo matura! - a bassi livelli nelle larve dal I al III STADIO - ad alti livelli nell ’ intestino e nelle ghiandole salivari nei dischi imaginali dell ’ occhio e nei lobi del cervello - poco espresso nei dischi imaginali dell ’ occhio e nei lobi del cervello

intestino ghiandole salivari Il trascritto del gene dronc in condizioni normali è : - altamente espresso negli embrioni, - espresso nella camera uovo matura! - a bassi livelli nelle larve dal I al III STADIO ad alti livelli nell ’ intestino e nelle ghiandole salivari - ad alti livelli nell ’ intestino e nelle ghiandole salivari - poco espresso nei dischi imaginali dell ’ occhio e nei lobi del cervello Una regione promotrice di 2.8 kb contiene la maggior parte delle informazioni richieste per una corretta espressione genica. Una regione di 1.1 kb è sufficiente per l’espressione solo in alcuni tessuti ( intestino, embrione)

Trasformazione genica mediata dal DNA nei Mammiferi Per analogia con i trasposoni usati in Drosophila si è cercato di sviluppare vettori che avessero IR affinchè l’inserimento nel genoma fosse favorito; ciò è risultato vero solo per le cellule in coltura-> inserendo sequenze tra due IR si osservano integrazioni nel genoma MA SOLO di cellule in coltura; non avviene in modo efficace negli oociti dei Mammiferi. È stato necessario un cambio di strategia per ottenere topi transgenici: - il DNA da inserire deve essere LINEARE, meglio se fornito come CONCATENAMERO testa-coda - l’integrazione avviene a livello di 1 cellula

Microiniezione di DNA nell’oocita fecondato di topo Si preparano delle femmine per la superovulazione Si prelevano le uova e si mettono su un vetrino e si effettua una FECONDAZIONE in vitro Si aspetta altri 25 giorni e si preleva il sangue dalla coda e si controlla per Southern o per PCR se il DNA iniettato si è inserito Si impiantano tutti gli embrioni microiniettati in una o più femmine pseudogravide, si aspetta 20 giorni e nascono i topini Pipetta di fissaggio Pronucleo maschile Pipetta in cui è stato precedentemente preparato il DNA pulito, linearizzato da iniettare I topini che mostrano il transgene inserito si incrociano per verificare che lo trasmettano alla progenie (e che si sia quindi inserito nelle cellule germinali) -> si dice topo fondatore il topo che ha il transgene inserito STABILMENTE nel suo genoma

Topi transgenici per l’ormone della crescita di ratto (1982) Pronucleo femminile Pronucleo maschile DNA linearizz a- to contenen te il gene per l’ormone della crescita di ratto, rGH sotto il controllo del promotor e della metalloti oneina* (Mt-1), concate- namero di (6000 copie) Impianto in una madre adottiva lit/lit È stato subito evidente che questo topo aveva l’ormone della crescita di ratto inserito PROGENIE cresciuta su metalli pesanti Di 20 embrioni che si sono sviluppati 6 presentavano l’ormone della crescita di ratto, visto per Southern blotting controllo rGH Mt-1 -> la metallotion eina è una proteina, ricca di cisteine che si lega ai metalli pesanti (Zn), importante per la detossifica zione; è regolata dagli stessi metalli pesanti e dai glucocortic oidi embrione omozigote per il gene del nanismo lit/lit (little) Topo lit/lit Topo lit/lit + rGH