Dott.ssa Lucia DECASTELLI IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta La ricerca degli allergeni negli alimenti: dai metodi tradizionali ai nanobiosensori Dott.ssa Lucia DECASTELLI Struttura Complessa Controllo Alimenti e Igiene delle Produzioni Centro Regionale Allergie e Intolleranze Alimentari IZS Torino Prof. Carlo RICCIARDI Dipartimento di Scienza Applicata e Tecnologia (DISAT) Politecnico di Torino Castello del Valentino, Torino - 2 aprile 2014

Cosa sono le allergie alimentari IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Cosa sono le allergie alimentari Ippocrate… Lucrezio… Accademia Europea di Allergologia ed Immunologia - Reazioni non tossiche - Suscettibilità individuale Intolleranze: enzimatiche, farmacologiche, indefinite Allergie: IgE mediate, non IgE mediate

Patogenesi scatenanti una reazione immunologica, spesso IgE mediata IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta INTOLLERANZE ALIMENTARI Reazione di ipersensibilità di natura non immunitaria, spesso legata alla quantità di alimento assunto. ALLERGIE ALIMENTARI Patogenesi scatenanti una reazione immunologica, spesso IgE mediata

Sintomi delle allergie alimentari IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Sintomi delle allergie alimentari Gastrointestinali Crampi addominali Diarrea Nausea Vomito Coliche Cutanei Gonfiore di labbra,bocca,lingua … Orticaria Eruzioni cutanee o rossori Eczema Respiratori Congestione nasale Starnuti Asma Tosse Difficoltà respiratorie Sistemici Shock anafilattico

Allergie alimentari: un problema di molti IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Allergie alimentari: un problema di molti Stati Uniti - 20% popolazione pensa di avere allergie alimentari - 4% adulti e 5% dei bambini : 3-6 % fino al 10% Europa - 1-2% adulti e 5-8% bambini Sottostima legata a raccolta dati non uniforme e diversi approcci diagnostici negli studi clinici

Allergie alimentari: un problema di molti IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Allergie alimentari: un problema di molti Italia in età pediatrica colpisce 6-8 %; nella popolazione adulta 3% - Alimenti causa di allergia primaria: alimenti vegetali 72% (frutta, legumi, pomodoro) crostacei e molluschi 13%, pesci 4%, Uova e latte 3% cereali 2% anisakis e altri ….

Evoluzione della normativa IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Evoluzione della normativa Direttiva 2000/13/CE D.Lvo 181/2003 Regola del 25% (ingredienti composti) Direttiva 2003/89/CE D.Lvo 114/2006 Abolizione regola del 25% Direttiva 2006/142/CE D.Lvo 178/2007 Inserimento Lupino e Molluschi Direttiva 2007/68/CE Legge 88/2009 Esclusione di alcuni derivati Reg. CE 1169/2011 In vigore dal 13/12/2014

P IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta P

Working Group EFSA “Food Allergy” IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Working Group EFSA “Food Allergy” EFSA 2004 “Opinion of the Scientific Panel on Dietetic Products, Nutrition and Allergies on a request from the Commission relating to the evaluation of allergenic foods for labelling purposes” EFSA 2012 “Literature searches and reviews related to the prevalence of food allergy in Europe

“può contenere tracce di…” IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Problematiche Mancanza di limiti quantitativi di legge per i diversi allergeni nell’alimento L’incertezza permane a livello di aziende produttive, di controllo ufficiale e dei consumatori “può contenere tracce di…”

Attività di controllo ufficiale allergeni in alimenti IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Attività di controllo ufficiale allergeni in alimenti - Piani di Controllo Ufficiale (Ministero Salute, Regioni) - Piani speciali dei NAS - Indagini a seguito di segnalazione di sintomatologia clinica - Allerte comunitarie

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Controlli ufficiali Reg. Piemonte 2007-2012 IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Controlli ufficiali Reg. Piemonte 2007-2012 % positività anno

Detection di allergeni in alimenti: IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Detection di allergeni in alimenti: i metodi tradizionali ELISA PCR 14 14 14

IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Limiti analitici - Fase di estrazione: effetto matrice e trattamenti tecnologici - Elevata variabilità nelle performance dei test presenti in commercio (Limite di rilevazione o quantificazione diversi) Mancanza di metodi di conferma ufficiali Necessità di sviluppo di metodi innovativi a supporto delle tecniche tradizionali 15 15 15

IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Progetto di ricerca “Messa a Punto di Dispositivi Nanotecnologici (Biosensori) per il Rilevamento di Allergeni in Alimenti di Origine Animale e Vegetale” - la Rete degli Istituti Zooprofilattici Sperimentali il Politecnico di Torino l’Università del Piemonte Orientale - l’Istituto Superiore di Sanità - il Consiglio Nazionale delle Ricerche - la Rete Allergologica della Regione Piemonte Progetto Ricerca Finalizzata Ministero della Salute

Obiettivi del progetto IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Obiettivi del progetto Messa a punto di metodi analitici innovativi - di screening - CITOMETRIA A FLUSSO - DIGITAL PCR - NANO-BIOSENSORI CANTILEVER - e di conferma - SPETTROMETRIA DI MASSA

IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Citometria a flusso La citrometria a flusso è un metodo di conteggio di elementi corpuscolati (cellule) o non corpuscolati (allergeni) adsorbiti a strutture inerti (microsfere lattice). I target vengono marcati con un colorante e fatti passare singolarmente attraverso un sistema ottico di rilevazione a flusso laminare e quindi conteggiate. Target Pro Contro Ovoalbumine Lattoglobuline Alti livelli di sensibilità Dispositivi e protocolli dispendiosi

IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Citometria a flusso Test per la ricerca di ovoalbumine in prodotti da forno Confronto esiti ELISA accreditato vs citofluorimetria

IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Digital PCR La DIGITAL PCR consente la rilevazione e la quantificazione assoluta degli acidi nucleici target combinando diluizioni limite, PCR end-point e statistiche di Poisson Target Pro Contro Crostaceo Alti livelli di sensibilità Necessità di protocolli di estrazione e purificazione

IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Digital PCR Test per la ricerca di dna crostaceo in preparato al pomodoro Linearità del metodo in digital PCR

Spettrometria di Massa IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Spettrometria di Massa La spettrometria di massa consente la rilevazione e la identificazione di sostanze attraverso la separazione di una miscela campione di ioni in funzione del loro rapporto massa/carica  Target Pro Contro Ovoalbumine Lattoglobuline Metodo di II livello Conferma Laboratorio attrezzato Iniziato iter di verifica performance e sucessiva validazione Collaborazione tra alcuni laboratori chimici piemontesi

… Nanocantilever IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Nanocantilever …

Materials and Processes for Micro and Nanotechnology Group (DISAT) IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Materials and Processes for Micro and Nanotechnology Group (DISAT) Missione Ricerca fondamentale su materiali e processi per le micro- e nano-tecnologie Progettazione e fabbricazione di dispositivi e nanosistemi Trasferimento tecnologico Didattica NanoBiosensori e Lab-On-Chip http://www.polito.it/micronanotech http://www.latemar.polito.it Staff 5 Professori 8 Ricercatori 22 Post Doc 10 Studenti di dottorato 3 Tecnici 2 Amministrativi

NanoBiosensori IZSTO R. Bashir, Adv. Drug Delivery Rev. 2005 Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta NanoBiosensori R. Bashir, Adv. Drug Delivery Rev. 2005

Lab-On-Chip (LOC) IZSTO STMicroelectronics Siemens NanoIdent Digital Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Lab-On-Chip (LOC) STMicroelectronics Siemens NanoIdent Digital

Cos’è un cantilever Trave vincolata a una estremità IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Cos’è un cantilever Trave vincolata a una estremità l >> w>> t Produzione su larga scala, con tecnologia a basso costo 27 27

Biosensori a CANTILEVER IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Biosensori a CANTILEVER frequenza di risonanza Quantificazione della massa Virus, Batteri Proteine Funghi, Spore 1Hz di shift tipicamente corrisponde a 1 picogrammo di molecole (10-12g) Tossine Quantificazione di analiti dai nanogrammi (10-9g) agli zeptograms (10-21g)

Risultati: b-lattoglobuline (I) IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Risultati: b-lattoglobuline (I) Obiettivo: sviluppo di un metodo di screening sensibile e quantitativo per la determinazione di allergeni negli alimenti Partner principali: IZSPLVA, CNR-ISPA, UniPMN-DSF Research grants: Ministero della Salute 2008 Fabbricazione dei Microcantilever in Si Ossidazione termica Silanizzazione (APTES) Linking (GA) Legame con Proteina G Incubazione con Ab (da kit ELISA) Incubazione con il campione Incubazione con Ab (sandwich) b-LG: MW = 18400 – 36800 Da

Risultati: b-lattoglobuline (II) IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Risultati: b-lattoglobuline (II) Mentre nel saggio diretto gli shift sono coperti dall'alto segnale del blank, dopo il legame con il secondo anticorpo le concentrazioni maggiori di 1 ppm sono ben visibili

Risultati: b-lattoglobuline (III) IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Risultati: b-lattoglobuline (III) Curva di concentrazione segue una sigmoide (tipica di saggi ELISA indiretti) LOD=0,4ppm LOQ=1ppm (confrontabili con ELISA commerciali)

Risultati: b-lattoglobuline (IV) IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Risultati: b-lattoglobuline (IV) Mentre nel saggio diretto gli shift sono coperti dall'alto segnale del blank, dopo il legame con il secondo anticorpo le concentrazioni maggiori di 0,1 ppm sono ben visibili

Risultati: b-lattoglobuline (V) IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Risultati: b-lattoglobuline (V) Curva di concentrazione segue una sigmoide (tipica di saggi ELISA indiretti) LOQ=0,1 ppm (migliore di ELISA commerciali)

Risultati: b-lattoglobuline (VI) IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Risultati: b-lattoglobuline (VI) Valutazione ageing del saggio: diminuzione della capacità di legame di Ab di circa il 20% in 4 mesi  LOQ = 0,5 ppm Quantificazione diretta della densità di anticorpi sulla superficie, in funzione della diluizione in volume

Conclusioni e prospettive future IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Conclusioni e prospettive future Nanobiosensori  alta sensibilità, basso costo Lab-On-Chip  portabilità, riduzione reagenti, automazione Nanobiosensori meccanici (cantilever) e allergeni: Con saggi sandwich LOD e LOQ confrontabili o migliori di saggi ELISA commerciali su beta-lattoglobuline Buona riproducibilità Possibilità di quantificazione

Grazie per l’attenzione IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta Grazie per l’attenzione Dott.ssa Lucia DECASTELLI Struttura Complessa Controllo Alimenti e Igiene delle Produzioni Centro Regionale Allergie e Intolleranze Alimentari IZS Torino Prof. Carlo RICCIARDI Dipartimento di Scienza Applicata e Tecnologia (DISAT) Politecnico di Torino Castello del Valentino, Torino - 2 aprile 2014