INTRODUZIONE La contaminazione fungina nelle matrici alimentari è causa di deterioramenti che possono determinarne l’inidoneità al consumo ed alla trasformazione. Diverse specie fungine inoltre possono sintetizzare le micotossine, metaboliti secondari, che costituiscono un grave pericolo per la salute umana ed animale a causa della loro ampia diffusione, elevata stabilità chimica e tossicità. L’identificazione dei funghi è ancora oggi principalmente basata su sistemi microbiologici di coltivazione ed osservazione dei caratteri morfologici che richiedono tempi lunghi. Le analisi molecolari basati sull’amplificazione del DNA mediante la reazione a catena della polimerasi (PCR), caratterizzate da elevata sensibilità, specificità, ripetibilità, rapidità e dall’assenza di variabilità legata al ciclo di sviluppo dell’organismo da identificare, possono rappresentare un’interessante alternativa ai metodi tradizionali. Scopo di questo studio è lo sviluppo di metodi di tipo quantitativo (PCR real-time) basati sull’amplificazione di specifiche sequenze target di DNA, per il rapido e precoce rilevamento dei funghi tossigeni Aspergillus carbonarius, A. flavus, A. parasiticus, Fusarium graminearum, Penicillium exspansum,, principali contaminanti rispettivamente di uva, mais, grano e mele. Patrizia De Rossi, Valentina Tolaini, Antonella Del Fiore, Chiara Nobili e Fabio Vitali ENEA – Agenzia nazionale per le nuove tecnologie, l’energia e lo sviluppo economico sostenibile Unità tecnica Sviluppo Sostenibile ed Innovazione del Sistema Agro-Industriale Laboratorio Innovazione Agro-Industriale (UTAGRI-INN) MATERIALI E METODI L’estrazione del DNA totale da ciascuna matrice è stata effettuata con il metodo TRIS- SDS Lysis Buffer seguendo il protocollo riportato da Farber (1997). Per ciascuna specie fungina sono stati individuati dei geni target su cui sono state disegnate coppie di primers specie-specifici utilizzate nelle prove di amplificazione PCR Real time (tabella 1). La PCR real-time è stata condotta in un termociclatore Applied Biosystem 7000 collegato ad un PC con apposito software per elaborazione dei dati. Il programma di amplificazione specifico per le singole coppie di primers è riportato nella tabella 2. RISULTATI E DISCUSSIONI I risultati delle amplificazioni in PCR real-time riportati in tabella 3 mostrano la presenza di DNA fungino in 34 dei 39 campioni analizzati. Le analisi microbiologiche tradizionali hanno confermato i risultati molecolari a dimostrazione della sensibilità e della capacità dei primers di diagnosticare precocemente la presenza del fungo direttamente sulla matrice reale. BIBLIOGRAFIA P. De Rossi et al. Quality Assurance and Safety of Crops & Foods. 3, , 2010 A. Del Fiore et al. Quality Assurance and Safety of Crops & Foods. 2, 22-27, 2010 C. Nobili et al. Journal of life sciences. 5(2), 2011 P. Färber at al. International Journal of Food Microbiology, 2 (36), , 1997 V. Tolaini et al. International Journal of Food Microbiology. 138(3), , 2010 CONCLUSIONI Nel presente lavoro è stata sviluppata una metodica molecolare di rilevamento precoce della contaminazione fungina in matrici alimentari (uve, grano, mele, mais) basata sull’amplificazione di sequenze target di DNA fungino con primers specie- specifici. Alle condizioni testate le coppie di primers utilizzate si sono contraddistinte per specificità ed elevata sensibilità nei confronti delle sequenze target di DNA fungino. I risultati ottenuti hanno permesso di individuare la presenza di Aspergillus carbonarius su uva, A. flavus e A. parasiticus su mais, Fusarium graminearum su grano e Penicillium expansum su mela. Le quantità di DNA fungino rilevate attraverso il protocollo di PCR real-time hanno evidenziato una sensibilità del metodo tale da permettere la determinazione nelle fasi iniziali dell’infezione, quando il micelio fungino non è ancora visibile ad osservazione allo stereomicroscopio. I risultati ottenuti confermano che le tecniche molecolari possono rappresentare un contributo concreto alla prevenzione della contaminazione fungina su scala commerciale, permettendo di individuare la presenza del fungo quando altri metodi ispettivi non lo consentono. Tabella 3- Quantificazione del DNA fungino in matrici reali attraverso amplificazione PCR Real time con primer specie-specifici: AcPKS per A. carbonarius in uva, N1-2 e tri5-tri6 per F. graminearum in grano, PG1 per P. expansum in mela, Afl R per A. flavus e A. parasiticus in mais. NR=DNA non rilevato Tabella 2-Protocollo di amplificazione PCR real- time utilizzato per ciascuna coppia di primer specie- specifici. Figura 1-Matrici alimentari sottoposte a screening PCR real time per la rilevazione di DNA fungino. Tabella 1-Sequenze nucleotidiche dei primers specie-specifici e lunghezza frammento amplificato (De Rossi et al., 2010; Del Fiore et al., 2010; Nobili et al. 2011, Tolaini et al, 2010)