Rintracciabilità degli alimenti di origine animale

Il tema della rintracciabilità nasce nel 1992, in seguito allo scandalo BSE (Bovine Spongiform Encephalopathy), una malattia del gruppo delle Encefalopatie Spongiformi Trasmissibili (TSE), causata da un agente infettivo definito “prione”, che genera lesioni degenerative conferenti al tessuto nervoso un aspetto spongioso (spongiforme: comparsa di vacuoli a livello dei neuroni). Normale Patologico

BSE in Europa Regno Unito13120 Germania77 Belgio90 Danimarca11 Spagna23 Francia1626 Irlanda 1520 Italia011 Lussemburgo00 Portogallo21 La crisi della BSE ha determinato un’accelerazione e una puntualizzazione della disciplina della rintracciabilità. Prof. Luigi Ramunno

L’interesse della collettività verso la sicurezza alimentare deriva anche dall’impatto complessivo generato da altre fonti di rischio come ad esempio i prodotti OGM. Prof. Luigi Ramunno

“…la possibilità di ricostruire e seguire il percorso di un alimento, di un mangime, di un animale destinato alla produzione alimentare o di una sostanza destinata o atta ad entrare a far parte di un alimento o di un mangime attraverso tutte le fasi della produzione, della trasformazione e della distribuzione…” Art. 18 Reg. CE 178/2002 Prof. Luigi Ramunno

In tempi diversi (prima e dopo la crisi BSE) anche per altri alimenti è stata prevista la tracciabilità: Grassi (Reg. CE n° 1638), Uova (Reg. CE n° 1651), Uva e sua trasformazione in vino (D.M ), Olio di oliva (Reg. CE n° 1019), Tabacco e latte fresco (D.M ). Prof. Luigi Ramunno

LE ETICHETTE, STRUMENTO DI TRASPARENZA E INFORMAZIONE “...l’insieme delle menzioni, delle indicazioni, dei marchi di fabbrica o di commercio, delle immagini o dei simboli che si riferiscono al prodotto alimentare e che figurano direttamente sull’imballaggio o su un’etichetta appostavi o sul dispositivo di chiusura o su cartelli o su anelli o fascette legate al prodotto medesimo...” Dlg. 109 del 1992; Dlg. 101 del 2003 Qualità e sicurezza alimentare Prof. Luigi Ramunno

Rintracciabilità dei prodotti alimentari Procedure Analitiche Analisi delle proteine Trovano applicazione solo sui prodotti non sottoposti a trattamenti termici intensi dal momento che le proteine subiscono processi degradativi durante la cottura. Analisi Morfologica dei tessuti Può essere utilizzata solo sui prodotti i cui tessuti non hanno subito modifiche in seguito a cottura o trattamenti meccanici, quali macinazione. Pecora Bovino Capra Prof. Luigi Ramunno

1. Il DNA è facilmente reperibile 2. Elevata sensibilità 3. Stabilità delle molecole di DNA Ogni soggetto ha una sua “Impronta Digitale” Prof. Luigi Ramunno

Rintracciabilità del latte di bufala Prof. Luigi Ramunno

DPCM 10 maggio 1993 GU n. 219 del 17 settembre 1993 Art. 3 - La "Mozzarella di bufala Campana DOP" è prodotta esclusivamente con latte di bufala intero, proveniente da bufale allevate in… …il latte deve essere consegnato al caseificio entro la sedicesima ora dalla mungitura… Prof. Luigi Ramunno

Mozzarella di Bufala Campana Un po di statistica… E’ un mercato in forte espansione con un incremento della produzione del 33 % nel periodo Nello stesso periodo il volume di affari è aumentato di circa 75 milioni di euro Prof. Luigi Ramunno

L‘ area di consumo coincide in prevalenza con l'area di produzione. Gran parte dei prodotti viene assorbito dai mercati campani e laziali. Dove però si concentrano anche il maggior numero di frodi. Mozzarelle in confezioni senza sigillo possono essere facilmente sostituite con mozzarelle non DOP Mozzarelle vendute al banco senza confezione possono essere facilmente sostituite con mozzarelle non DOP Prof. Luigi Ramunno

Attività Ispettiva Consorzio di TutelaN.A.S. Ispettorato Centrale Repressioni Frodi La Mozzarella di Bufala Campana DOP è stato nel 2003 il formaggio DOP più controllato in assoluto Prof. Luigi Ramunno

● 130 ispezioni presso locali commerciali sull’intero territorio nazionale Consorzio di TutelaN.A.S. Ispettorato Centrale Repressioni Frodi Attività Ispettiva Al 29 dicembre 2006 i caseifici DOP risultano essere 132 Attività ispettiva del Consorzio di Tutela al 29 dicembre 2006: ● 306 analizzati e circa il 10% hanno riscontrato la presenza di latte non bufalino ● 11 sequestri convalidati relativi a 13 procedimenti per uso irregolare del marchio DOP ● 6 interventi aggiuntivi, in collaborazione con Istituto Centrale Repressione Frodi e con il contributo delle ASL. Prof. Luigi Ramunno

CostituenteBufaloBovinoCapraPecora Acquag Proteineg Grassig Lattosiog EnergiaKcal Ac. Grassi Saturig Insaturig Colesterolomg Composizione Chimica del latte di varie specie La frode più comune è la sofisticazione per aggiunta di latte di altre specie Caprino Ovino Bovino Prof. Luigi Ramunno

CostituenteBufaloBovinoCapraPecora Acquag Proteineg Grassig Lattosiog EnergiaKcal Ac. Grassi Saturig Insaturig Colesterolomg Resa%~24.6~13.0~12.5~23.0 Composizione Chimica del latte di varie specie Resa alla trasformazione CapraPecoraBovinoBufalo

Specifico e Monomorfo all’interno della specie Bufalina Bovina Ovina Caprina Marcatore molecolare Sequenza SINE al 5’ del gene che codifica per l’α-lattalbumina (Isaac et al., 2001). Prof. Luigi Ramunno

Sequenza SINE al 5’ del gene che codifica per l’α-lattalbumina Prof. Luigi Ramunno Bovino delezione di ~180bp Bufalo delezione di ~170bp Capra delezione di ~110bp Pecora 746 bp BOVINO.TXT 1 GCTCAGGTTC AGAATCTTGT TTTATAGGCT CTAGGTGTAT ATTGTGGGGC TTCCCTGGTG 60 BUFALO.TXT 1 GCTCAGGTTC AGAATCTTGT TTTATAGGCT CTAGGTGTAT ATTGTGGGGC TTCCCTGGTG 60 CAPRA.TXT 1 GCTCAGGTTC AGAATCTTGT TTTATAGGCT CTAGGTGTAT ATTGTGGGGC TTCCCTGGTG 60 PECORA.TXT 1 GCTCAGGTTC AGAATCTTGT TTTATAGGCT CTAGGTGTAT ATTGTGGGGC TTCCCTGGTG BOVINO.TXT BUFALO.TXT 61 ATCCAGGTAG CAPRA.TXT 61 ATCCAGGTAG CTGCATTCAG TCATGGCAAT GACCAAACTG CGGGTCTCAG CCAATCGACT 120 PECORA.TXT 61 ATCCAGGTAG CTGCATTCAG TCATGGCAAT GACCAAACTG CGGGTCTCAG CCAATCGACT BOVINO.TXT BUFALO.TXT CAPRA.TXT 121 ACACGTCA PECORA.TXT 121 ACACGTCAAG ATGTCATTTA AACAGTCAGT ACAGTGACTG GACAAAATAG ATCACAAAAT BOVINO.TXT GCTCAG 240 BUFALO.TXT GCTCAG 240 CAPRA.TXT GCTCAG 240 PECORA.TXT 181 GCATGACAAT GCGTGGGCAT CCATGTTTGC ATGACATACA GATAGGCCCA GTAAGCTCAG BOVINO.TXT 241 ATGGTAAAGT GTCTGCCTGC AATGTGGGTG ATCTGGGTTC GATCCCTGGC TTGGGAAGAT 300 BUFALO.TXT 241 ATGGTAAAGT GTCTGCCTGC AATGTGGGTG ATCTGGGTTC GATCCCTGGC TTGGGAAGAT 300 CAPRA.TXT 241 ATGGTAAAGT GTCTGCCTGC AATGTGGGTG ATCTGGGTTC GATCCCTGGC TTGGGAAGAT 300 PECORA.TXT 241 ATGGTAAAGT GTCTGCCTGC AATGTGGGTG ATCTGGGTTC GATCCCTGGC TTGGGAAGAT BOVINO.TXT 301 CCCCTGGAGA AGGAAATGGC AACCCACTCT AGTACTCTTA CCTGGAAAAT TCCATGGACA 360 BUFALO.TXT 301 CCCCTGGAGA AGGAAATGGC AACCCACTCT AGTACTCTTA CCTGGAAAAT TCCATGGACA 360 CAPRA.TXT 301 CCCCTGGAGA AGGAAATGGC AACCCACTCT AGTACTCTTA CCTGGAAAAT TCCATGGACA 360 PECORA.TXT 301 CCCCTGGAGA AGGAAATGGC AACCCACTCT AGTACTCTTA CCTGGAAAAT TCCATGGACA BOVINO.TXT 361 GAGGAGCCTT GTAAGCTACA GTCCATGGGA TTGCAAAGAG TTGAACACAA CTGAGCAACT 420 BUFALO.TXT 361 GAGGAGCCTT GTAAGCTACA GTCCATGGGA TTGCAAAGAG TTGAACACAA CTGAGCAACT 420 CAPRA.TXT 361 GAGGAGCCTT GTAAGCTACA GTCCATGGGA TTGCAAAGAG TTGAACACAA CTGAGCAACT 420 PECORA.TXT 361 GAGGAGCCTT GTAAGCTACA GTCCATGGGA TTGCAAAGAG TTGAACACAA CTGAGCAACT BOVINO.TXT 421 AAGCACAGCA CAGTACAGTA TACACCTGTG AGGTGAAGTG AAGTGAAGGT TCAATGCAGG 480 BUFALO.TXT 421 AAGCACAGCA CAGTACAGTA TACACCTGTG AGGTGAAGTG AAGTGAAGGT TCAATGCAGG 480 CAPRA.TXT 421 AAGCACAGCA CAGTACAGTA TACACCTGTG AGGTGAAGTG AAGTGAAGGT TCAATGCAGG 480 PECORA.TXT 421 AAGCACAGCA CAGTACAGTA TACACCTGTG AGGTGAAGTG AAGTGAAGGT TCAATGCAGG BOVINO.TXT 481 GTCTCCTGCA TTGCAGAAAG ATTCTTTACC ATCTGAGCCA CCAGGGAAGC CCAAGAATAC 540 BUFALO.TXT 481 GTCTCCTGCA TTGCAGAAAG ATTCTTTACC ATCTGAGCCA CCAGGGAAGC CCAAGAATAC 540 CAPRA.TXT 481 GTCTCCTGCA TTGCAGAAAG ATTCTTTACC ATCTGAGCCA CCAGGGAAGC CCAAGAATAC 540 PECORA.TXT 481 GTCTCCTGCA TTGCAGAAAG ATTCTTTACC ATCTGAGCCA CCAGGGAAGC CCAAGAATAC BOVINO.TXT 541 TGGAGTGGGT AGCCTATTCC TTCTCCAGGG GATCTTCCCA TCCCAGGAAT TGAACTGGAG 600 BUFALO.TXT 541 TGGAGTGGGT AGCCTATTCC TTCTCCAGGG GATCTTCCCA TCCCAGGAAT TGAACTGGAG 600 CAPRA.TXT 541 TGGAGTGGGT AGCCTATTCC TTCTCCAGGG GATCTTCCCA TCCCAGGAAT TGAACTGGAG 600 PECORA.TXT 541 TGGAGTGGGT AGCCTATTCC TTCTCCAGGG GATCTTCCCA TCCCAGGAAT TGAACTGGAG BOVINO.TXT 601 TCTCCTGCAT TTCAGGTGGA TTCTTCACCA GCTGAACTAC CAGGTGGATA CTACTCCAAT 660 BUFALO.TXT 601 TCTCCTGCAT TTCAGGTGGA TTCTTCACCA GCTGAACTAC CAGGTGGATA CTACTCCAAT 660 CAPRA.TXT 601 TCTCCTGCAT TTCAGGTGGA TTCTTCACCA GCTGAACTAC CAGGTGGATA CTACTCCAAT 660 PECORA.TXT 601 TCTCCTGCAT TTCAGGTGGA TTCTTCACCA GCTGAACTAC CAGGTGGATA CTACTCCAAT BOVINO.TXT 661 ATTAAAGTGC TTAAAGTCCA GTTTTCCCAC CTTTCCCAAA AAGGTTGGGT CACTCTTTTT 720 BUFALO.TXT 661 ATTAAAGTGC TTAAAGTCCA GTTTTCCCAC CTTTCCCAAA AAGGTTGGGT CACTCTTTTT 720 CAPRA.TXT 661 ATTAAAGTGC TTAAAGTCCA GTTTTCCCAC CTTTCCCAAA AAGGTTGGGT CACTCTTTTT 720 PECORA.TXT 661 ATTAAAGTGC TTAAAGTCCA GTTTTCCCAC CTTTCCCAAA AAGGTTGGGT CACTCTTTTT BOVINO.TXT 721 TAACCTTCTG TGGCCTACTC TGAG BUFALO.TXT 721 TAACCTTCTG TGGCCTACTC TGAG CAPRA.TXT 721 TAACCTTCTG TGGCCTACTC TGAG PECORA.TXT 721 TAACCTTCTG TGGCCTACTC TGAG

Denaturazione (94-95°C) Separazione completa dei due filamenti del DNA Annealing appaiamento di primers al DNA (la temperatura varia Estensione Polimerizzazione della Taq polimerasi Prof. Luigi Ramunno

5’3’ 5’3’ 5’ 3’ Btu63109R  -la F Capra BufaloBovino  -la F 570 bp 580 bp 638 bp 5’ 3’ Btu63109R Pecora  -la F 746 bp Sequenza SINE al 5’ del gene che codifica per l’α-lattalbumina Prof. Luigi Ramunno

1) Bovino 570 bp 2) Bufalo 580 bp 3) Caprino 638 bp 4) Ovino 746 bp 5) Mix bovino/ bufalo 6) Mix caprino/ovino 7) Mix totale 1000 bp 600 bp 700 bp M Prof. Luigi Ramunno

Tecniche di biologia molecolare applicate all’analisi della variabilità genetica

Cronologia dello sviluppo delle Biotecnologie Molecolari 1865 Mendel presenta i suoi esperimenti di ibridazione 1944 Si dimostra che il DNA è materiale genetico 1953 Watson e Crick determinano la struttura del DNA 1973 Boyer e Cohen fondano la tecnologia del DNA ricombinante 1975 Sviluppo di tecniche per analizzare e sequenziare il DNA 1978 Genentech produce insulina umana ricombinante in E.coli 1982 Il primo farmaco GM: l’insulina 1982Primo vaccino animale prodotto con tecnologie ricombinanti (epatite B) introdotto in UE 1983 Sviluppo di un vettore per le piante 1983 La prima pianta transgenica: il tabacco 1985 Reazione a catena della polimerasi (PCR)

Com’era l’analisi genetica prima della PCR? Il sequenziamento del DNA (1975) richiedeva che i geni venissero prima clonati in appositi vettori (plasmidi o fago l) Il Southern blotting (1975) permetteva un’analisi approssimativa dei geni (RFLPs, inserzioni e delezioni) La costruzione di genoteche e lo screening potevano richiedere molti mesi e le genoteche dovevano essere preparate per ciascun individuo analizzato

Preparazione dei campioni prima della corsa elettroforetica Nel Southern blot il DNA (sia genomico che plasmidico) viene digerito con enzimi di restrizione.

Southern Blotting (DNA)

L’invenzione della PCR Ideata da Kary Mullis nel 1983 La prima pubblicazione è apparsa nel 1985 Premio Nobel per la chimica nel 1995 Serve per ottenere una grande quantità di una specifica sequenza di acido nucleico in vitro Può amplificare un tratto di acido nucleico per più di 1 milione di volte L’acido nucleico diviene più facile da manipolare e viene utilizzato in tutti gli esperimenti di Biologia molecolare DNA RNA DNA Estrazione del DNA o DNA o RNA dal campione Elettroforesi Amplificazion e trascrizion e inversa

–DNA O RNA –Primer (18-25 nt di lunghezza) –dNTP (desossinucleotidi trifosfati) –Buffer di reazione (tampone) –MgCl 2 –Taq Polimerasi Composizione di una reazione di PCR

Primer Disegnati mediante un software, utilizzando come stampo le sequenze relative al gene depositate in EMBL. ASSUMONO UN DOPPIO RUOLO FUNZIONANO DA SONDA, CERCANDO LUNGO IL GENOMA LA SEQUENZA SPECIFICA A CUI LEGARSI RICONOSCIUTA LA REGIONE AGISCONO DA INNESCO

PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) Strumento per ottenere molte copie di una sequenza di DNA La reazione di amplificazione avviene ad opera di un enzima, la DNA polimerasi, e di sonde (primer) Il processo di amplificazione avviene in tre fasi o ciclo: 1)Denaturazione del DNA ad una temperatura di circa 94 °C 2)Ibridazione del primer ad una temp. da 45 a 65 °C 3)Estensione del nuovo frammento ad una temp. di circa 72 °C Tale ciclo si ripete n volte. La reazione viene effettuata in un termostato programmabile I prodotti possono essere visualizzati su un gel d’agarosio

Separazione di macromolecole per mezzo di elettroforesi sul gel

Analisi quantitativa attraverso l’uso di Real-time PCR E’ una tecnica, basata sull’impiego di molecole fluorescenti (SYBR Green, FAM, TAMRA, ecc…), che consentono di monitorare la reazione di amplificazione ciclo dopo ciclo. L’emissione di fluorescenza è direttamente correlato alla quantità di DNA amplificato, ciò permette di avere corrette quantificazioni dei prodotti di partenza Prof. Luigi Ramunno

5’ 3’ RQ Q R TaqMan TM probe Integra non emette fluorescenza Distrutta è libera di emettere fluorescenza Prof. Luigi Ramunno

5’ 3’ 5’3’ TaqMan TM 5’ 3’ R Q 5’ 3’ Taq 3’ QR 5’ 3’ Q Taq R 5’ 1. Taglio della sonda 2. Polimerizzazione Completa 5’ 3’ Q Taq R 3’ 5’ 3. Fluorescence Detection 5’ 3’ Q Taq R 5’ R Denaturazione 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’3’ 5’3’ Annealing Taq 5’ 3’ R Q Estensione

L’ammontare di DNA amplificato è correlato all’ammontare iniziale di DNA target: QF = QI (1 +  ) (n-1) dove: QF = Quantità finale di DNA amplificato QI = Quantità di DNA target prima della PCR  = Efficienza di Amplificazione (tra 0 e 1) n = numero di cicli Prof. Luigi Ramunno

Curva di Amplificazione PCR n L’efficienza non è 100% n Una fase lineare segue quella esponenziale n Possibilità di plateaus n Il plateau non è correlato all’iniziale quantità di target DNA CyclesTheoretical Real Life Log Target DNA Qual’è la realtà Prof. Luigi Ramunno

96 Repliche di una identica reazione danno diverse quantità finali di prodotti di PCR QF = QI (1 +  ) (n-1)  = efficienza

Quale è la fase migliore per avere esatte informazioni di quantificazione? Durante la fase esponenziale: -Nessun fattore è limitante -I prodotti di amplificazione si accumulano in modo costante L’inizio della fase esponenziale Prof. Luigi Ramunno Il ciclo soglia, C t, di 96 repliche dello stesso campione mostra valori identici Il ciclo soglia (Ct) è il ciclo della reazione di amplificazione in cui il segnale di fluorescenza del campione si porta al di sopra del valore di soglia.

Il ciclo soglia (C t ) n Correlato fortemente con l’ammontare iniziale di DNA target u Se la concentrazione [C] di template è doppia, il C t si raggiungerà un ciclo prima u Se la concentrazione [C]di template è la metà, il C t si raggiungerà un ciclo dopo u Se la concentrazione [C] di template è la metà, il C t si raggiungerà un ciclo dopo Qual è il più [C]? Il meno [C]?

Applicazione dell’analisi quantitativa alla specie suina Prof. Luigi Ramunno

Marcatore molecolare: 17° ESONE CSN1S ) campione individuale di DNA suino 2) campione individuale di DNA ovino 3) campione individuale di DNA caprino 4) campione individuale di DNA bovino 5) campione individuale di DNA bufalino SUINO 1 TCTATTTTGA GCCTCTCCAC CAGTTCTACC AGCTTGATGC CTATCCCTAT 50 OVINO GCTTTTCAGA CAATTCTACC AGCTGGACGC CTATCCATCT 50 CAPRINO GCTTTTCAGA CAATTCTACC AGCTGGACGC CTATCCATCT 50 BOVINO GCTTTTCAGA CAATTCTACC AGCTGGATGC CTATCCATCT 50 BUFALO GCTTTTCAGA CAATTCTACC AGCTGGATGC CTATCCATCT SUINO 51 GCTACCTGGT ATTATCCTCC AC AATATATTG CTCACCCATT 100 OVINO 51 GGTGCCTGGT ATTACCTTCC ACTAGGCACA CAATACACTG ATGCCCCCTC 100 CAPRINO 51 GGTGCCTGGT ACTACCTTCC ACTAGGCACA CAATACACTG ATGCCCCCTC 100 BOVINO 51 GGTGCCTGGT ATTACGTTCC ACTAGGCACA CAATACACTG ATGCCCCATC 100 BUFALO 51 GGTGCCTGGT ATTACGTTCC ACTAGGCACG CAATACCCTG ATGCCCCATC SUINO 101 ATTCACCAAC ATCCCTCAAC CCACTGCCCC TGAGAAGGGT GGAAAAACTG 150 OVINO 101 ATTCTCTGAC ATCCCTAATC CCATTGGCTC TGAGAACAGT GGAAAGATT- 150 CAPRINO 101 ATTCTCTGAC ATCCCTAATC CCATTGGCTC TGAGAACAGT GGAAAGACT- 150 BOVINO 101 ATTCTCTGAC ATCCCTAATC CTATTGGCTC TGAGAACAGT GAAAAGACT- 150 BUFALO 101 ATTCTCTGAC ATCCCTAATC CCATCGGCTC TGAGAACAGT GGAAAGACT- 150 SUINO 151 AGATTATGCC TCAGTGGTGA AGAATTAAGT GAATTCTCAG GAACTCCACA 200 OVINO ACTATGCC ACTGTGGTGA AGAGTCAAGT GAATTCTGAG GAACTCCACA 200 CAPRINO ACTATGCC ACTGTGGTGA AGAGTCAAGT GAATTCTGAG GAACTCCACA 200 BOVINO ACTATGCC ACTGTGGTGA GGAGTCAAGT GAATTCTGAG GGACTCCACA 200 BUFALO ACTATGCC ACTGTGGTGA AGAGTCAAGT GAATTCTGAG GGACTCCACA SUINO 201 ATTATGGCCT TTG OVINO 201 ATTATGGTCT TTG CAPRINO 201 ATTATGGTCT TTG BOVINO 201 GTTATGGTCT TTG BUFALO 201 ATTATGGTCT TTG

100 ng 10 ng 1 ng 0.1 ng 0.01 ng Log Starting Quantity Starting QuantityThreshold Cycle (medio) 2100 ng ng ng ng ng32.09

Log. Starting QuantityStarting QuantityCt. Treshold med ng / ng / ng / ng / ng / Prof. Luigi Ramunno

Analisi su prodotti commerciali ProdottoDichiarato in EtichettaRisultato delle analisi effettuate Wurstel Prodotto di sola carne di pollo e tacchino 0.06% di DNA Suino (0.035 ng) / (138 ng) Wurstel Prodotto di carne equina (45%) e suina (55%) 59 % di DNA Suino (29.63 ng) / (50 ng) Tortellino Prodotto di sola carne suina54% di DNA suino (9 ng) / (16 ng) Prof. Luigi Ramunno

…facciamo il conto della massaia 100 litri di latte costano 130 €90 € Con 100 litri produco 24 Kg Se vendo a 12 € al Kg ricavo 288 € Il conto totale è: 288 € € = € 18 Kg 216 € 216 € - 90 € = € Ma la frode davvero conviene? 100%Mix 50%+50% Mozzarella 100 €93 € 18 Kg 216 € 216 € - 93 € = € 24 Kg 288 € 288 € € = € Capra 0.56€/lt Pecora 0.7€/lt Bovino 0.5€/lt Bufalo 1.3€/lt Prezzo latte Prof. Luigi Ramunno

Sequenziamento del DNA (1): strutture dei nucleotidi

Sequenziamento del DNA (2): il metodo di Sanger * Indica il primer (lungo 15 nucleotidi) ** I dNTP sono ad una concentrazione 100 volte superiore di quella dei ddNTP in ciascuna provetta Il contenuto di ciascuna provetta viene caricato in 4 pozzetti separati di un gel di poliacrilamide Caricati in 4 tubi di reazione

Sequenziamento del DNA (3): il metodo di Sanger pozzetti autoradiogramma Si legga la sequenza man mano sintetizzata dal basso verso l’alto. Il nucleotide G è il più vicino al primer (* indica il primer (lungo 15 nucleotidi)) e l’estremità 5’ mentre il nucleotide T è all’estremità 3’. 5’GCTCCACGTAACGT3’ Questa sequenza è complementare al filamento stampo.

Sequenziamento automatico