Cromatografia Università degli studi di Napoli Federico II S.I.C.S.I. VIII ciclo Laboratorio di Chimica Analitica Cromatografia Docente Prof. S. Andini

Tecniche di separazione Metodi Cromatografici Classe di riferimento: quarto anno ITIS (specializzazione Chimica).   Prerequisiti: fondamenti di chimica generale e organica, conoscenza di altre metodiche di separazione quali: cristallizzazione, distillazione ed estrazione con solventi. Numero Lezione teoriche: 3 da 50 minuti. (Introduzione ai principi e metodi; cromatografia su colonna e su strato sottile). Supporti e materiali didattici: libri di testo di teoria, per esercitazione scritta e manuale di laboratorio. Lavagna tradizionale e lavagna luminosa, dispense, utilizzo di esempi pratici durante il laboratorio con materiali di uso comune . Obiettivi: apprendimento degli aspetti teorici sulla cromatografia e dei principali meccanismi di separazione; conoscenza della cromatografia su colonna e su strato sottile; comprensione dei vari fattori che incidono sulla separazione dei costituenti di una miscela; criteri per la scelta della fase mobile e della fase stazionaria.

La cromatografia Mikhail S. Tsvett Mikhail S. Tsvett, botanico russo, separò su di una colonna i pigmenti delle foglie verdi (1906); la separazione era visualizzata dalla comparsa di bande colorate, da cui il nome CROMATOGRAFIA che deriva infatti dal greco e significa “scrittura con il colore” La cromatografia è una tecnica di separazione abbastanza recente, fu ideata nel 1906 dal botanico russo Mikhail Tswett nell’affrontare lo studio dei carotenoidi. Egli immerse foglie verdi in etere di petrolio e versò la miscela in un tubo di vetro (colonna) riempito di carbonato di calcio. Mentre la soluzione percolava attraverso la colonna, i vari componenti si spostavano a diverse velocità, dando luogo a una successione di bande orizzontali di diversi colori. In questo modo separò alcuni pigmenti delle piante. Il termine cromatografia deriva infatti dal greco e significa "scrittura con il colore“

La cromatografia Qualsiasi tipo di cromatografia si basa sulla distribuzione dei componenti la miscela da separare fra una fase fissa ed una fase mobile. Miscela di componenti da separare B  e A  Miscela A+B Processo cromatografico B A Qualsiasi tipo di cromatografia si basa sulla ripartizione dei componenti della miscela da separare tra due fasi, di cui una stazionaria, fissa, ed una fase mobile che passa attraverso la fase stazionaria, vediamo in figura una miscela di due componenti separati mediante un processo cromatografico.

Tecniche cromatografiche Possono essere classificate: In base alla forma del letto cromatografico Cromatografia su colonna (impaccata, open-tubular) Cromatografia planare (su carta, su strato sottile) In base allo stato fisico della fase mobile Cromatografia Liquida (LC) Gascromatografia (GC)

Stato fisico della fase mobile Cromatografia Liquida (LC): la fase mobile è un liquido nel quale siano solubili i componenti della miscela da separare; la fase stazionaria deve essere insolubile nella fase mobile. Gascromatografia (GC): la fase mobile è un gas che funge da carrier per i componenti della miscela. In base allo stato fisico della mobile possiamo classificare le tecniche cromatografiche come segue:

Forma del letto cromatografico Cromatografia planare: la fase stazionaria è distribuita su una superficie piana, che può essere un supporto cartaceo (cromatografia su carta, PC) o una lastrina in vetro o altri materiali (cromatografia su strato sottile, TLC).

Forma del letto cromatografico CROMATOGRAFIA SU COLONNA Cromatografia su colonna: la fase stazionaria è contenuta all’interno di una colonna cilindrica, che può riempire completamente (colonna impaccata) oppure rivestirne la superficie interna (colonna tubulare).

Cromatografia su colonna La colonna viene “impaccata” con la fase stazionaria; la miscela dei composti da separare viene “caricata” sulla sommità; la fase stazionaria viene continuamente dilavata dal flusso di solvente (fase mobile), si stabiliscono equilibri dinamici; composti diversi scendono lungo la colonna a velocità diverse; le frazioni vengono, poi, raccolte separatamente.

Il coefficiente di distribuzione La distribuzione dei componenti la miscela nelle due fasi, dipende dalle interazioni che essi instaurano con la fase fissa e con la fase mobile. [campione] nella fase fissa [campione] nella fase mobile Kd = È’ necessario scegliere le fasi mobile e stazionaria in modo che i composti da separare siano caratterizzati da coefficienti di distribuzione diversi.

Interazioni soluto-fasi legami a idrogeno attrazione coulombiana interazioni dipolo-dipolo interazioni dipolo-dipolo indotto forze di Van der Waals formazione di composti di interazione interazioni steriche In tutte queste interazioni svolge un ruolo solitamente decisivo la polarità delle due fasi. Spesso possono essere presenti più tipi di interazione nello stesso processo cromatografico.

Fase stazionaria silice allumina carbonato di calcio/magnesio Le caratteristiche di una fase stazionaria ideale sono: Non reagire con il soluto né catalizzare reazioni Non adsorbire irreversibilmente il soluto Non solubilizzarsi nell’eluente né interagire con esso Riuscire ad adsorbire molte sostanze in modo riproducibile Permettere un facile percoramento dell’eluente silice allumina carbonato di calcio/magnesio ossido di magnesio carbone attivo polistirene o altri polimeri saccarosio (Tswett) LE FASI STAZIONARIE (ADSORBENTI) Le caratteristiche di una fase stazionaria ideale sono: Non reagire con il soluto né catalizzare reazioni Non adsorbire irreversibilmente il soluto Non solubilizzarsi nell’eluente né interagire con esso Riuscire ad adsorbire molte sostanze in modo riproducibile Permettere un facile percoramento dell’eluente

Fase mobile In genere il potere eluente di un solvente varia in funzione della polarità, del tipo di adsorbente adoperato, della natura delle sostanze da separare e della temperatura Etere di petrolio < cicloesano < tetracloruro di carbonio < <toluene < cloruro di metilene < cloroformio < etere etilico < acetato di etile < acetone < propanolo < etanolo < metanolo < acqua < acido acetico È possibile utilizzare tali solventi in miscele di varia composizione, così da realizzare fasi mobili con potere eluente variabile.

Meccanismi della separazione adsorbimento ripartizione esclusione molecolare scambio ionico affinità In base ai tipi di interazione prima descritti possiamo suddividere i meccanismi di separazione impiegati in cromatografia in:

Adsorbimento Ripartizione La fase stazionaria è un solido in polvere steso su un supporto; sulla superficie dei granuli si trovano siti attivi che possono stabilire legami deboli (reversibili!) con le molecole della miscela da separare. In questo caso, ogni componente della miscela da separare che attraversa la fase solida attiva viene adsorbito sulla superfice adsorbente. La cromatografia di adsorbimento è utilizzata per separare sostanze neutre polari o non polari, di natura organica o inorganica. Ripartizione La fase stazionaria è un liquido che impregna un solido granulare inerte o è ad esso chimicamente legato. Si basa sul fatto che le componenti di una miscela verranno separate sfruttando la diversa solubilità nel liquido di fase mobile e stazionaria. Quindi una sostanza viene trascinata più velocemente quanto minore è la sua solubilità nella fase staz. e maggiore è nella fase mobile.

Cromatografia di esclusione molecolare Fase stazionaria: gel (poliacrilammide, agarosio) I gel sono polimeri organici che possiedono una rete tridimensionale di pori. Principio del metodo La separazione è regolata non dalle interazioni fra le fasi ma dal fatto che il soluto può o meno penetrare nel granulo rigonfiato. Facendo passare attraverso il gel una miscela costituita da molecole di diverse dimensioni, avverrà una separazione tra i componenti di questa miscela, in base alle dimensioni delle molecole Il fattore determinante è la dimensione dei pori del granulo (accessibilità del granulo).

Cromatografia a scambio ionico Fase stazionaria: scambiatori di ioni su matrice insolubile Le resina scambiatrici si dividono in due classi: resine cationiche: hanno un gruppo scambiatore negativo e controione positivo; scambiano cationi resine anioniche: hanno un gruppo scambiatore positivo e controione negativo; scambiano anioni Principio del metodo Il principio su cui si basa è l’attrazione fra particelle cariche di segno opposto. Facendo passare una miscela composta da ioni(+), quest’ultimi tenderanno a spostare i controioni(+). Si fa passare la fase mobile composta da ioni(+) che entrano in competizione con gli ioni della miscela e si avrà un distacco graduale di essi a seconda della loro forza con la fase stazionaria.

Cromatografia di affinità Fase stazionaria: solida – gruppi specifici (ligandi) Un “ligando” ad alta affinità per la molecola biologica di interesse è legato ad una matrice; la molecola d’interesse si lega al ligando ed è immobilizzata sulla colonna (interazione soluto-fase stazionaria); le altre molecole vengono “lavate via”; la molecola di interesse può essere eluita scindendo i legami precedentemente instaurati cambiando l’eluente Consente di separare molecole in base a interazioni altamente specifiche

Cromatografia planare Si tratta di tecniche di cromatografia liquida di semplicissima applicazione, spesso impiegate per avere informazioni preliminari. La fase stazionaria è supportata su lastre di vetro, fogli di alluminio o di plastica nella versione TLC (Thin Layer Chromatography) e su fogli di carta da filtro nella versione PC (Paper Chromatography). Le fasi stazionarie più usate sono il gel di silice e l’allumina per la cromatografia di adsorbimento, la cellulosa per la ripartizione liquido-liquido (in questo caso la fase stazionaria è l’acqua adsorbita sulle particelle di cellulosa). Si tratta di un gruppo di tecniche di cromatografia liquida di semplicissima applicazione, spesso impiegate per avere informazioni preliminari.

TLC L’esecuzione dell’analisi è molto semplice: la miscela da separare va depositata sulla superficie, mediante un capillare sottilissimo. La goccia di campione viene versata al centro della linea, precedentemente segnata a matita, che indica il punto di partenza del processo di eluizione Quindi il foglio o la lastrina si pone in una vaschetta (camera di sviluppo) contenente la fase mobile che per capillarità (modalità ascendente) fluisce sulla fase fissa trascinando differentemente gli analiti, separandoli. Una volta estratta la lastrina dalla vaschetta si traccia a matita il ‘fronte del solvente’, cioè il punto finale del processo di eluizione.

Rf = danalita / deluente TLC Il parametro che caratterizza i soluti separati è il fattore di ritenzione, Rf. deluente Per ogni analita il valore di Rf è il rapporto tra la distanza tra il centro della macchia e la linea di base, danalita e la distanza che intercorre tra il fronte dell’eluente e la linea base, deluente : Rf = danalita / deluente Il valore di Rf degli analiti è quindi sempre compreso tra 0 e 1. I valori ottimali sono compresi tra 0.4 e 0.8 danalita

Punto di applicazione del campione Fronte del solvente Sostanze separate

Metodi di rivelazione Quando le macchie non sono visibili cioè se le molecole non contengono gruppi cromoforo si ricorre a metodi di rivelazione UV.

Altri metodi di rivelazione Nell’immagine sotto è mostrato un contenitore per l’aspersione di ninidrina su lastrine TLC o PC. Alcuni esempi di reagenti correntemente impiegati per evidenziare le macchie sono riportati nella tabella sottostante: Reagente Utilizzo Cristalli di Iodio per composti azotati AgNO3 in NH3 per sostanze riducenti Alizarina per cationi Ninidrina per amminoacidi e ammine HS2 per cationi e metalli pesanti

TLC La TLC è utilizzata per: seguire i prodotti di una sintesi in laboratorio; trovare la miscela di eluenti migliore con cui eseguire una LC; identificare i prodotti di una reazione per confronto.