Università degli Studi di Napoli “Federico II” Facoltà di Farmacia Corso di Biochimica e Biologia Molecolare - CQ

Colture Primarie: cellule isolate direttamente da un tessuto animale in grado di compiere un numero finito di divisioni cellulari in vitro, dopodiché vanno incontro a morte Linee cellulari continue: cellule opportunamente modificate in modo da renderle capaci di replicarsi indefinitamente (IMMORTALI)

Le cellule possono crescere: in sospensione aderenti Le cellule crescono e si moltiplicano Le cellule crescono in mezzo fluido senza aderire aderendo alla Es.: cellule di origine emopoietica superficie della piastra da coltura Es.: cellule di tessuti solidi

Fornisce i metaboliti e i fattori di crescita necessari alla proliferazione cellulare: Glucosio Aminoacidi Vitamine Sali Minerali (Na, K, Ca, Mg etc) Fattori di crescita, di adesione ed ormoni (SIERO) Antibiotici per prevenire contaminazioni batteriche Per la crescita le cellule richiedono un valore di pH del terreno di coltura compreso tra 7.2 e 7.4 garantito da un sistema tampone fosfato-bicarbonato IL TERRENO DI COLTURA

Per mantenere costante tale valore di pH si usano incubatori contenenti il 5% di CO 2. Queste apparecchiature consentono di mantenere una temperatura costante di 37°C.

Per prevenire le contaminazioni è necessario: 1) Utilizzare solo materiale sterile; 2) Destinare il laboratorio solo alle colture cellulari; 3) Operare sempre sotto cappa a flusso laminare; 4) Pulire bene la cappa a inizio e fine lavoro; 5) Controllare periodicamente i filtri della cappa; 6) Mantenere pulito l’incubatore. Per prevenire le contaminazioni è necessario: 1) Utilizzare solo materiale sterile; 2) Destinare il laboratorio solo alle colture cellulari; 3) Operare sempre sotto cappa a flusso laminare; 4) Pulire bene la cappa a inizio e fine lavoro; 5) Controllare periodicamente i filtri della cappa; 6) Mantenere pulito l’incubatore.

DOVE TROVARE LE LINEE CELLULARI Produzione in laboratorio Banche cellule: -European Collection of Cell Culture ( -AmericanTissueCultureCentre (USA) ( -National Cell Culture Center (USA) ( -IST Servizio Biotecnologie (

LINEA CELLULARE ORIGINE CaCo-2 Colon Adenocarcinoma Umano C6 Glioma di ratto HeLa Carcinoma della Cervice Umano H9c2 Cardiomioblasti di ratto SK-N-BE Neuroblastoma Umano

Le colture cellulari possono essere materiale di partenza per l’estrazione di acidi nucleici e proteine

SONICATORE POTTER TESSUTI CELLULE DETERGENTI OMOGENATO

Centrifugazione

LA CENTRIFUGAZIONE CONSENTE DI SEPARARE I COMPONENTI CELLULARI IN BASE A: DIMENSIONIDIMENSIONI DENSITÀDENSITÀ FRAZIONAMENTO CELLULARE MEDIANTE CENTRIFUGAZIONE

DIMENSIONI FORMA CARICA

Acido Aspartico Treonina Serina Lisina Valina Fenilalanina Tirosina Leucina

Cellule Controllo CTRL VS Cellule Trattate = Invariata = Invariata Aumenta Aumenta Diminuisce Diminuisce VALUTAZIONE DELL’ESPRESSIONE DELLA PROTEINA DI INTERESSE ESPRESSIONE DELLA PROTEINA

ELETTROFORESI: MIGRAZIONE DI PARTICELLE CARICHE (PROTEINE, ACIDI NUCLEICI) SOTTO L’AZIONE DI UN CAMPO ELETTRICO WESTERN BLOT: DETERMINAZIONE QUALITATIVA E/O SEMIQUANTITATIVA DI PROTEINE ELETTROFORESIE WESTERN BLOT

GEL DI POLIACRILAMMIDE MISCELA DI ACRILAMIDE E BIS-ACRILAMIDE AGENTI CHE FAVORISCONO LA POLIMERIZZAZIONE (TEMED) Effetto “setaccio” dell’acrilammide

PREPARAZIONE DEL CAMPIONE PROTEICO PROTEINE (OMOGENATO) AGGIUNTA DI: -MERCAPTOETANOLO  -MERCAPTOETANOLO SODIO DODECILSOLFATO (SDS) BOLLITURA S S

DENATURAZIONE Proteina nativa 2-MeS Proteina denaturata  -MERCAPTOETANOLO S S S S

RUOLO DEL SODIODODECILSOLFATO (SDS)

CARICAMENTO DEI CAMPIONI PROTEICI

TRASFERIMENTO

ANTICORPI ANTICORPO PROTEINA DI INTERESSE

INCUBAZIONE CON ANTICORPO (Ab) PRIMARIO INCUBAZIONE CON UN ANTICORPO CHE RICONOSCE SPECIFICAMENTE LA PROTEINA DI INTERESSE Ab PRIMARIO

INCUBAZIONE CON Ab SECONDARIO SI AGGIUNGE L’ANTICORPO SECONDARIO CHE RICONOSCE L’ANTICORPO PRIMARIO E LO LEGA L’ANTICORPO SECONDARIO E’ ASSOCIATO AD UN ENZIMA CHE PERMETTE L’IDENTIFICAZIONE DEL COMPLESSO ANTICORPO-PROTEINA Ab SECONDARIO LEGATO ALL’ENZIMA RIVELAZIONE

REAZIONE di CHEMIOLUMINESCENZA Enzima PEROSSIDASI: Enzima FOSFATASI ALCALINA: substrato incolore prodotto blu

LASTRA AUTORADIOGRAFICA I NUMERI A FIANCO DELLE BANDE SONO RELATIVI AI PESI MOLECOLARI DI DETERMINATE PROTEINE L’INTENSITA’ DELLA BANDA E’ PROPORZIONALE ALLA QUANTITA’ DI PROTEINA PRESENTE

CTRL Trattato CTRLTrattato RISULTATO

SEPARAZIONE DELLE PROTEINE SCOPO: isolare la proteina di interesse dal totale delle proteine estratte dalla cellula o dal tessuto I metodi per separare le proteine sfruttano le seguenti caratteristiche chimico-fisiche: carica dimensioni solubilità affinità di legame con altre molecole

- Molecole con proprietà diverse si ripartiscono in modo diverso tra la fase mobile e quella stazionaria e quindi si separano PRINCIPI

I metodi cromatografici utilizzati nella purificazione delle proteine vengono classificati in base alla natura delle interazioni che si instaurano tra la proteina e la fase stazionaria: Filtrazione su gel Affinità Scambio ionico TIPI DI CROMATOGRAFIA

CROMATOGRAFIA SU COLONNA Le colonne sono generalmente in vetro e di varie dimensioni

Il riempimento della colonna avviene con supporto granulare inerte (gel di silice) o resina a scambio ionico (per cromatografia ionica) che costituirà la FASE STAZIONARIA Si carica la miscela da separare L’eluizione avviene con un opportuno solvente detto ELUENTE che viene fatto fluire attraverso la colonna

I componenti trattenuti nella FASE STAZIONARIA si muovono più lentamente di quelli che rimangono nella fase mobile Il solvente usato per l’eluizione (eluente) trascina le sostanze così separate fino all’uscita della colonna dove verranno raccolte separatamente matrice campione eluizione proteine separate

GEL FILTRAZIONE Sfrutta l’interazione tra la proteina e la matrice polimerica, costituita da microsfere a porosità controllata Separazione in base alle dimensioni Materiali utilizzati: Oligosaccaridi Acrilamidi

Le proteine interagiscono con i pori delle microsfere e vengono trattenute in base alla loro dimensioneLe proteine interagiscono con i pori delle microsfere e vengono trattenute in base alla loro dimensione Le proteine più piccole rimangono intrappolate nella matrice, quelle più grandi no e vengono “lavate via” con l’eluenteLe proteine più piccole rimangono intrappolate nella matrice, quelle più grandi no e vengono “lavate via” con l’eluente

CROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICO Sfrutta le interazioni elettrostatiche tra gruppi carichi della proteina e cariche opposte presenti sulla matrice della fase stazionaria Separazione delle proteine in base alla carica

Fase stazionaria: contiene gruppi ionizzabili accoppiati ad una matrice inerte fatta di cellulosa o di agarosio Le proteine da purificare si legano ai gruppi carichi della fase stazionaria e vengono così ritardate in base alla loro carica Scambio anionico: fase stazionaria con carica positiva Scambio cationico: fase stazionaria con carica negativa

CROMATOGRAFIA PER AFFINITÁ Sfrutta le interazione altamente specifiche di una proteina con piccoli substrati Fase stazionaria: matrice inerte (agarosio, destrano, poliacrilamide) sulla quale viene legato covalentemente un ligando Braccio spaziatore: facilita le interazioni tra il ligando e la proteina bersaglio Ligando: ha affinità elevata per catturare la proteina di interesse, ma non così alta da impedire il suo distacco senza denaturazione Eluizione: la proteina viene recuperata mediante il suo distacco dal ligando

ligando ad alta affinitàUn ligando ad alta affinità per la proteina è legato alla matrice La proteina di interesse si lega al ligando e viene immobilizzata sulla colonna Le altre proteine vengono “lavate” via

La selettività della cromatografia di affinità è potenzialmente la più alta delle altre forme di cromatografia