DIAGNOSI MOLECOLARE DI UNA MALATTIA GENETICA E SVILUPPO DI UNA TERAPIA GIUSEPPINA ANDREOTTI M.VITTORIA CUBELLIS

PREMESSA Tutte le informazioni presenti in questa presentazione non sostituiscono in alcun modo il giudizio di un medico specialista, l'unico autorizzato ad effettuare una consulenza medica ed esprimere un parere medico.

MALATTIA DI FABRY SINTOMI, ETA’ DI INSORGENZA E GRAVITA’ VARIABILI

DAI SEGNI CLINICI ALLA DIAGNOSI MOLECOLARE atgcagctgaggaacccagaactacatctgggctgcgcgcttgcgcttcgcttcctggccctcgtttcctgggacatccctgggg ctagagcactggacaatggattggcaaggacgcctaccatgggctggctgcactgggagcgcttcatgtgcaaccttgactgcc aggaagagccagattcctgcatcagtgagaagctcttcatggagatggcagagctcatggtctcagaaggctggaaggatgca ggttatgagtacctctgcattgatgactgttggatggctccccaaagagattcagaaggcagacttcaggcagaccctcagcgct ttcctcatgggattcgccagctagctaattatgttcacagcaaaggactgaagctagggatttatgcagatgttggaaataaaac ctgcgcaggcttccctgggagttttggatactacgacattgatgcccagacctttgctgactggggagtagatctgctaaaatttg atggttgttactgtgacagtttggaaaatttggcagatggttataagcacatgtccttggccctgaataggactggcagaagcatt gtgtactcctgtgagtggcctctttatatgtggccctttcaaaagcccaattatacagaaatccgacagtactgcaatcactggcg aaattttgctgacattgatgattcctggaaaagtataaagagtatcttgcactggacatcttttaaccaggagagaattgttgatg ttgctggaccagggggttggaatgacccagatatgttagtgattggcaactttggcctcagctggaatcagcaagtaactcagat ggccctctgggctatcatggctgctcctttattcatgtctaatgacctccgacacatcagccctcaagccaaagctctccttcagg ataaggacgtaattgccatcaatcaggaccccttgggcaagcaagggtaccagcttagacagggagacaactttgaagtgtgg gaacgacctctctcaggcttagcctgggctgtagctatgataaaccggcaggagattggtggacctcgctcttataccatcgcag ttgcttccctgggtaaaggagtggcctgtaatcctgcctgcttcatcacacagctcctccctgtgaaaaggaagctagggttctat gaatggacttcaaggttaagaagtcacataaatcccacaggcactgttttgcttcagctagaaaatacaatgcagatgtcattaa aagacttactttaaaa USCITE DALLA MODALITA’ SCHERMO INTERO E COPIATE LA SEQUENZA

Ricordiamo? il DNA …..

ANALIZZEREMO IL DNA DI UN PAZIENTE PER IDENTIFICARE DELLE DIFFERENZE RISPETTO AI SANI UTILIZZEREMO IL PROGRAMMA BLAST E UNA BANCA DATI CHE CONSERVA LE SEQUENZE DEL DNA UMANO DI RIFERIMENTO

UNA BANCA DATI DI SEQUENZE E’ UNA COLLEZIONE DI FILE COME QUELLO CHE VEDRETE ANDANDO AL LINK.LINK OGNI FILE CONTIENE: LA SEQUENZA NUCLEOTIDICA DI UN GENE O DI UN RNA, SE SI TRATTA DI UNA BANCA DATI NUCLEOTIDICA LA SEQUENZA DI UNA PROTEINA, SE SI TRATTA DI UNA BANCA DATI DI PROTEINE VOGLIAMO CONFRONTARE LA SEQUENZA DEL DNA DEL PAZIENTE CON OGNUNA DELLE SEQUENZE PRESENTI NELLA BANCA DATI. ANCHE LIMITANDOCI ALLE SEQUENZE UMANE, QUESTO E’ IMPOSSIBILE DA FARE SENZA L’AIUTO DI UN PROGRAMMA

IL PROGRAMMA SI CHIAMA BLAST (NUCLEOTIDE)(NUCLEOTIDE) NELLA PAGINA INSERIREMO LA SEQUENZA NUCLEOTIDICA DEL PAZIENTE E SCEGLIEREMO COME ORGANISMO “HOMO SAPIENS” poi

L’OUTPUT DEL PROGRAMMA CI DICE CHE IL FRAMMENTO DI DNA CHE STIAMO ANALIZZANDO CORRISPONDE AL GENE CHE CODIFICA PER LA ALPHA-GALATTOSIDASI E CHE C’E’ UNA DIFFERENZA FRA IL GENE DEL PAZIENTE E IL GENE DI UN INDIVIDUO SANO Query 721 AGTATCTTGCACTGGACATCTTTTAACCAGGAGAGAATTGTTGATGTTGCTGGACCAGGG 78 ||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 750 AGTATCTTGGACTGGACATCTTTTAACCAGGAGAGAATTGTTGATGTTGCTGGACCAGGG 809 LA DIFFERENZA CHE VEDIAMO AL LIVELLO DEL DNA DEL PAZIENTE PUO’ ESSERE ANALIZZATA AL LIVELLO DELLA PROTEINA. CIOE’ POSSIAMO TRADURRE LA SEQUENZA NUCLEOTIDICA DEL GENE DEL PAZIENTE UN PO’ COME AVVIENE NELLA CELLULA. POTETE FARLO VOI STESSI SE CONOSCETE IL CODICE GENETICO. DESIDERATE UN PICCOLO SUGGERIMENTO RIGUARDO ALLA TRASCRIZIONE DEL DNA E LA TRADUZIONE ?? paziente Banca dati/sano

Ricordiamo? L’mRNA così formato migra nel citoplasma Nei ribosomi avviene il processo di TRADUZIONE che è l’inizio della sintesi delle proteine

Ricordiamo? L’RNA di trasporto (tRNA) porta con sé un amminoacido. Il ribosoma è la fabbrica della proteina.

Ricordiamo? Il codice è formato di triplette di basi chiamate codoni.

Query 721 AGT ATC TTG CAC TGGACATCTTTTAACCAGGAGAGAATTGTTGATGTTGCTGGACCAGGG 780 ||| ||| ||| | | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 750 AGT ATC TTG GAC TGGACATCTTTTAACCAGGAGAGAATTGTTGATGTTGCTGGACCAGGG 809 S I L 732:3=244 p.D244H

ABBIAMO SCOPERTO CHE: IL PAZIENTE HA UNA MUTAZIONE NEL GENE DELLA ALPHA GALATTOSIDASI QUESTA MUTAZIONE COMPORTA LA SOSTITUZIONE DI UN AMMINOACIDO, L’ACIDO ASPARTICO 244 CON UNA ISTIDINA MA QUAL’E’ LA FUNZIONE DELLA ALPHA GALATTOSIDASI? ALPHA GALATTOSIDASI GALATTOSIO

MA COME QUALE E’ LA STRUTTURA TRIDIMENSIONALE DELLA ALPHA- GALATTOSIDASI? INTERROGHIAMO UN SITO PER CONFRONTARE LA SEQUENZA DEL PAZIENTE CON QUELLA DI RIFERIMENTO UMANA. IL PROGRAMMA SI CHIAMA BLAST (BLASTX)BLASTX NELLA PAGINA CHE APPARIRA’ INSERIREMO LA SEQUENZA NUCLEOTIDICA DEL PAZIENTE E SCEGLIEREMO COME ORGANISMO “HOMO SAPIENS” E SCEGLIAMO COME BANCA DATI PDB, LA BANCA DATI DOVE SONO CONSERVATE LE STRUTTURE DELLE PROTEINE. NELLE DIAPOSITIVE SUCCESSIVE VEDRETE COME SI PRESENTERA’ L’INPUT E QUALE SARA’ L’OUTPUT.

IL PROGRAMMA SI CHIAMA BLASTX INSERIREMO LA SEQUENZA NUCLEOTIDICA DEL PAZIENTE, SCEGLIEREMO COME BANCA DATI PDB E COME ORGANISMO “HOMO SAPIENS” poi

DA USARE PER LA RICERCA NELLA PROTEIN DATA BANK PDBPDB

NELLA PAGINA DELL’OUTPUT GUARDATE A DESTRA. TROVATE UN LINK “DOWNLOAD FILES” SI APRIRA’ UNA TENDINA, SCEGLIETE PDB File (TEXT)

PER VISUALIZZARE LA STRUTTURA DI UNA PROTEINA ABBIAMO BISOGNO DI UN PROGRAMMA DI GRAFICA. NE ESISTONO VARI, IL PIU’ SEMPLICE E’ RASMOL CHE SI PUO’ SCARICARE GRATUITAMENTE.RASMOL TROVERETE IL PROGRAMMA NELLA CARTELLA CHE AVETE SCARICATO. APRITE IL FILE 1R46 CON RASWIN ANDATE SU COLOURS E SCEGLIETE CHAIN VEDRETE CHE L’ALPHAGALATTOSIDASI E’ FATTA DA DUE CATENE UGUALI. CERCATE LA FINESTRA DI CONTROLLO DI RASWIN E SCRIVETE: SELECT 231 OR 170 (CON QUESTO COMANDO AVETE SELEZIONATO I DUE AMMINOACIDI DEL SITO ATTIVO OSSIA LE “MANI” DELL’ALPHA-GALATTOSIDASI) CONTINUATE POI A SCRIVERE IN SEQUENZA: COLOR GREEN SPACEFILL SELECT 244 (QUESTO E’ L’AMMINOACIDO MUTATO NEL PAZIENTE) COLOR RED SPACEFILL VEDRETE CHE IL SITO DELLA MUTAZIONE E’ LONTANO DAL SITO ATTIVO, PER QUESTO L’ENZIMA DEL PAZIENTE E’ ANCORA IN GRADO DI FUNZIONARE SE STABILIZZATO

DALLA DIAGNOSI ALLA TERAPIA ABBIAMO LANCIATO 2 PROGRAMMI, BLAST, UN PROGRAMMA CHE DATA UNA SEQUENZA, CERCA IN UNA BANCA DATI UNA SEQUENZA IDENTICA O SIMILE, E RASMOL, UN PROGRAMMA PER LA VISUALIZZAZIONE DELLE STRUTTURE DELLE PROTEINE. ABBIAMO UTILIZZATO DUE BANCHE DATI, UNA BANCA DATI DI SEQUENZE NUCLEOTIDICHE ED UNA BANCA DATI DI PROTEINE. ABBIAMO VERIFICATO CHE IL PAZIENTE HA UNA MUTAZIONE NEL GENE DELL’ALPHA GALATTOSIDASI, CHE LA MUTAZIONE MODIFICA UNA PROTEINA IMPORTANTE, MA CHE LA MODIFICA NON IMPEDISCE ALLA ALPHA GALATTOSIDASI DI FUNZIONARE. LA PROTEINA MUTATA E’ PIU’ “DEBOLE” DI QUELLA SANA, MA POTREBBE ESSERE RINFORZATA LEGANDO AD ESSA UN FARMACO. DOBBIAMO CERCARE IN UNA BANCA DATI CHE CONTIENE STRUTTURE CHIMICHE LA MOLECOLA CHE HA LA CAPACITA’ DI LEGARSI ALL’ALPHA GALATTOSIDASI.

RICORDERETE CHE LA ALPHA GALATTOSIDASI PRODUCE GALATTOSIO. LA PROTEINA LEGA GALATTOSIO, GALACTOSE IN INGLESE. PROVIAMO A CERCARE IN ZINC NEL MODO PIU’ SEMPLICE, TEXT, UNA MOLECOLA SIMILE AL GALATTOSIO, GALACTO*ZINC

CONOSCIAMO LA STRUTTURA DELLA PROTEINA, 1R46, OTTENUTA DALLA BANCA PDB, ABBIAMO SCELTO UNA MOLECOLA, , OTTENUTA DALLA BANCA DATI ZINC. ABBIAMO BISOGNO DI UN PROGRAMMA CHE PREVEDA COME LA MOLECOLA SIMILE AL GALTTOSIO POSSA LEGARSI ALLA ALPHA GALATTOSIDASI. IL PROGRAMMA SI CHIAMA SWISSDOCK, E’ GRATUITO MA MOLTO LENTO.SWISSDOCK NELLA DIAPOSITA SUCCESSIVA VEDRETE LA PAGINA DELL’INPUT DOVE INSERIREMO COME TARGET 1R46 E COME LIGAND

ALPHA GALATTOSIDASI DALLO STUDIO IN SILICO ALLO STUDIO IN VITRO COLTURE DI FIBROBLASTI SENZA LIGANDO - CON LIGANDO + ANALISI MEDIANTE ELETTROFORESI DI PROTEINE E VISUALIZZAZIONE MEDIANTE L’USO DI ANTICORPI SPECIFICI

GRAZIE PER L’ATTENZIONE E GRAZIE A….. TELETHONTELETHON PER AVER FINANZIATO LA NOSTRA RICERCA