Clonaggio funzionale Clonaggio posizionale Conoscenza proteina Malattia genetica Determinazione sequenza amminoac.Mappatura genetica con marcatori polimorfici Deduzione sequenza nucleotidicaIdentificazione cloni genomici che coprono il sito mappato Sintesi sonda oligonucleotidicaRicerca del gene (varie tecniche) Isolamento clone di cDNADeduzione della struttura aminoac. Isolamento clone genomicoRicerca mutazioni nucleotidiche Caratterizzazione clone genomicoRicerca funzione proteica Ricerca delle mutazioni

METODI DI CLONAGGIO

CLONAGGIO ATTRAVERSO VETTORE

ENZIMI DI RESTRIZIONE

DIGESTIONE MULTIPLA E CLONAGGIO

CLONAGGIO, TRASFORMAZIONE E SELEZIONE SINGOLI CLONI

SpecieDimensioni del genoma (bp) Numero di cloni Frammenti da 17 kb da 35 kb E. coli4,6 x S. cerevisiae1,8 x D. melanogaster1,2 x Riso5,7 x Uomo3,2 x Rana2,3 x Numero di cloni necessario per costruire librerie genomiche N = ln (1 – P) / ln (1- a/b) a = dimensione media del frammento b = totale del genoma da clonare P = probabilità che qualunque frammento sia clonato

STIMA DELLA RELAZIONE TRA DISTANZA GENETICA E FISICA Stima della distanza genetica totale (in cM) nella specie umana: somma della lunghezza totale dei cromosomi ottenuta dalla mappatura genetica con marcatori polimorfici Nel maschio = 2644 cM Nella femmina = 4481 cM Per 3000 Mb = 3 x 10 9 bp di genoma Maschio 1 cM = 1.13 Mb = 1.13 x 10 6 bp Femmina 1 cM = 0.67 Mb = 0.67 x 10 6 bp Media : 1 cM = 0.9 Mb = 0.9 x 10 6 bp

MAPPATURA FISICA COSTRUZIONE DI LIBRERIE GENOMICHE A PARTIRE DA DNA OTTENUTO DA: DNA GENOMICO TOTALE IBRIDI SOMATICO-CELLULARI PANNELLI DI IBRIDI MONOCROMOSOMICI PANNELLI DI IBRIDI CON CROMOSOMI DELETI IBRIDI DA RADIAZIONE SINGOLI CROMOSOMI ISOLATI CON CITOMETRIA A FLUSSO

SEPARAZIONE DI CROMOSOMI CON CITOMETRIA A FLUSSO

COSTRUZIONE DI UNA LIBRERIA DI DNA GENOMICO TOTALE

VETTORI DI CLONAGGIO DIMENSIONI DELL’INSERTO Vettori plasmidici standard Kb Vettori lambda Kb Vettori cosmidici Kb Vettori BAC (cromosomi artificiali batterici)fino a 300 Kb Vettori YAC (cromosomi artificiali di lievito) Mb Libreria di DNA genomico in termini di genoma-equivalenti 1 genoma equivalente: 3000 Mb/40 Kb = cloni indipendenti LIBRERIE DI GENOMA UMANO

ASSEMBLAGGIO DEI CLONI IN CONTIGUI ATTRAVERSO: 1) walking cromosomico: - con cloni interi (e soppressione di sequenze ripetitive); - con le estremità dei cloni 2) fingerprinting per identità di: - mappa di frammenti di restrizione - presenza DNA ripetitivo in frammenti di restrizione, - prodotti PCR compresi tra elementi ripetuti (IRE, intersperse repetitive elements, es. Alu) 3) contenuto di Sequence Tagged Site (STS) (Siti contrassegnati da una sequenza)

DIGESTIONE PARZIALE DEL DNA E PRODUZIONE DI CLONI CON FRAMMENTI CHE SI SOVRAPPONGONO

CHROMOSOME WALKING

FINGERPRINTING PER MAPPA DI FRAMMENTI DI RESTRIZIONE Presenza nei diversi cloni di frammenti di restrizione della stessa dimensione

FINGERPRINTING DEI CLONI PER PRESENZA DI DNA RIPETITIVO IRE = elementi ripetuti intercalati, es sequenze Alu: inter Alu-PCR

ASSEMBLAGGIO DI CLONI MEDIANTE ANALISI DEL CONTENUTO DI SEQUENCE TAGGED SITE (STS) (SITI ETICHETTATI DA UNA SEQUENZA) STS = sequenza a singola copia amplificabile con PCR La presenza del prodotto PCR di peso molecolare atteso rivela la presenza di quella STS all’interno di un clone

METODI PER L’ANALISI DEI CLONI GENOMICI PER ORDINARLI IN CONTIGUI - Distribuzione dei cloni in piastre da microtitolazione per produrre griglie ordinate - Produzione di filtri con i singoli cloni da utilizzare per analisi con ibridazione - Produzione di pool di DNA di cloni e selezione attraverso PCR specifiche

- Piastra agar con cloni ricombinanti -Trasferimento delle singole colonie in piastre da microtitolazione con pozzetti con terreno (96 pozzetti per microtiter) - Produzione filtro corrispondente

Screening di intere librerie genomiche con PCR su pool di DNA

Libreria specifica del cromosoma 6 con cloni ordinati su griglia - Piastra di agar 22 x 22 cm con cloni ricombinanti -Trasferimento delle singole colonie in piastre di microtitolazione con pozzetti con terreno (96 pozzetti per microtiter) - Trasferimento delle singole colonie in piastre da microtitolazione ad alta densità 96 x 4 = 384 pozzetti per microtiter - Trasferimento automatizzato su filtro 54 microtiter x 384 pozzetti = cloni = 4 genomi equivalenti

ASSEMBLAGGIO DEI CLONI IN CONTIGUI ATTRAVERSO: 1) walking cromosomico: - con cloni interi (e soppressione di sequenze ripetitive); - con le estremità dei cloni 2) fingerprinting per identità di: - mappa di frammenti di restrizione - presenza DNA ripetitivo in frammenti di restrizione, - prodotti PCR compresi tra elementi ripetuti (IRE, intersperse repetitive elements, es. Alu), 3) contenuto di Sequence Tagged Site (STS) (Siti contrassegnati da una sequenza)

ALLINEAMENTO DI YAC PER CONTENUTO DI STS

Screening di intere librerie genomiche con PCR su pool di DNA

-Ogni Master pool = 9 piastre x 96 pozzetti = 864 DNA di YAC - Pool di ogni singola piastra delle 9 - Pool di colonna es: da A1 a H11 - Pool di riga es: da A1 a A12 Scomposizione nelle singole piastre della master pool 12: PCR positiva nella piastra G Riga E Colonna 5 Individuazione con PCR della/e master pool: 5, 12 e 33 Master pool ANALISI DI UNA INTERA LIBRERIA GENOMICA TRAMITE SAGGI DI PCR

CLONAGGIO POSIZIONALE: UTILIZZO DEI MARCATORI ASSOCIATI GENETICAMENTE PER COSTRUZIONE DI UN CONTIGUO DI CLONI GENOMICI