La meccanica della mitosi

INTERPHASEPROPHASE Centrosomes (with centriole pairs) Chromatin NucleolusNuclear envelope Plasma membrane Early mitotic spindle Centrosome Chromosome, consisting of two sister chromatids Fragments of nuclear envelope Kinetochore Spindle microtubules Figure 8.6

METAPHASETELOPHASE AND CYTOKINESIS Metaphase plate SpindleDaughter chromosomes Cleavage furrow Nucleolus forming Nuclear envelope forming ANAPHASE Figure 8.6 (continued)

Gli Attori: Una cellula Cromosomi Il fuso mitotico: Microtubuli… ma non solo Motori proteici e altro ancora

Anatomia di un cromosoma

Chromosome maintenance Origins of replication Telomeres Centromeres

Problema n°1 replicare e compattare ma non separare

Figure Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) COHESIN Fino alla separazione i cromatidi fratelli sono tenuti saldamente insieme

Figure (part 3 of 3) Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) Le porzioni di DNA più ricche di GpC si duplicano per ultime

Soluzione:

Le condensine e le coesine hanno struttura e funzione correlate: Entrambe le proteine hanno domini di legame all’DNA e all’ATP identici ad un’estremità e una regione di cerniera nell’altra, collegate da due regioni lunghe e a “coiled-coil”. Questa struttura flessibile è ben adatta per il loro ruolo come molecole che formano legami incrociati con il DNA. soluzione Le condensine e le coesine

Le coesine formano legami incrociati tra due cromatidi fratelli, incollandoli insieme. Le condensine mediano legami incrociati intramolecolari per creare delle anse nel DNA nel processo di condensazione dei cromosomi. SMC (structural maintenance of chromosome) Le SMC hanno domini ATPasici

Condensin Cohesin From Uhlman (2001) Cur. Op. Cell Biol. 13:754 Scc1 Scc3 Pds5 Smc1 Smc3 Coesione inizia in fase-S

Condensin Cohesin Chromosome Compaction Chromosome Cohesion Scissile Subunit (Scc1) Cleaved at M/A From Uhlman (2001) Cur. Op. Cell Biol. 13:754

Cohesion is Established in S-phase Cdc6 ORC MCM Proteins Cdc28 Cdc7 Cdc28 Replication Factors Origin Assembly / Activation preRC Origin FiringOrigin Inactivation Elongating Repl. Fork Actvie Cohesin From Susan Forsburg, Salk Institute

Le condensine Condensins cause chromatin to be more tightly coiled by introducing positive supercoils into DNA. Condensins are responsible for condensing chromosomes at mitosis. Chromosome-specific condensins are responsible for condensing inactive X chromosomes in C. elegans. La fosforilazione delle condensine è uno dei fattori che determinano la condensazione della cromatina

Condensin is Required for Chromosome Compaction Cohesin is Required for Chromosome Compaction

Condensin is Required for Chromosome Compaction Cohesin is Required for Chromosome Compaction Cohesin links Condensin from adjacent sister chromatids

Le code amino terminali degli istoni del core nucleosomale sono essenziali per la condensazione cromosomica H1 e’ substrato di ciclina B/ Cdk1, tuttavia la condensazione cromosomica in estratti mitotici di Xenopus avviene anche senza H1 La coda N-terminale dell’istone H3 e’ essenziale per la condensazione mitotica

Il centromero Il centromero (o regione CEN) è una regione specifica del cromosoma eucariotico. Storicamente è definito come "costrizione primaria del cromosoma" in quanto corrisponde alla regione in cui il cromosoma condensato (chiamato anche mitotico) risulta più sottile, assomigliando a una sorta di strozzatura decentrata.

Il centromero è composto da DNA altamente ripetuto che non codifica per nessun gene ed è fortemente eterocromatico. La funzione di questa regione è prettamente strutturale nei processi di segregazione cromosomica in quanto vi si assembla una struttura proteica chiamata cinetocore. Il cinetocore iteragisce con i microtubuli del fuso mitotico e permette la segregazione dei cromatidi fratelli nelle due cellule figlie durante il processo di anafase I e II della meiosi o durante l'anafase mitotica, se ciò non accadesse si avrebbero dei seri danni alle future cellule.

IL CENTROMERO Il centromero è una struttura indispensabile del cromosoma eucariotico che consente di tenere uniti i due cromatidi fratelli di ciascun cromosoma fino alla metafase e consente altresì una corretta separazione dei due cromatidi fratelli all’anafase. Per potere funzionare in modo corretto, ogni cromosoma deve possedere un solo centromero: cromosomi senza centromero o con due centromeri (dicentrici) si ripartiscono in modo anomalo durante la mitosi determinando la formazione di cellule figlie con corredo genico non bilanciato.

Il centromero rappresenta una struttura altamente differenziata del cromosoma costituito da DNA e proteine. Negli eucarioti superiori può essere suddiviso in tre domini: dominio di appaiamento, dominio centrale cinetocore.

Il dominio centrale Il dominio centrale è composto dal cosiddetto DNA centromerico che nella maggior parte degli eucarioti superiori è composto da DNA satellite che forma l’eterocromatina costitutiva, ovvero quella cromatina che rimane inattiva e non trascritta per tutto il ciclo cellulare e in tutti i tipi di cellule. Per esempio, le regioni centromeriche dei cromosomi umani contengono una sequenza di DNA di circa 170 bp ripetuta in tandem e denominata alfa-satellite. Il dominio d’appaiamento comprende la superficie interna del centromero, dove i cromatidi fratelli si appaiano mediante specifiche proteine, quale ad esempio la proteina INCENP (Inner CENtromere Protein). Il dominio di appaiamento ha l’importante funzione di tenere uniti i cromatidi fratelli dopo la replicazione del DNA, fino alla successiva metafase. Il dominio d’appaiamento

CDE = CENTROMERIC DNA ELEMENTS CBF = CENTROMERE BINDING FACTORS lievito

Piastra interna: DNA α-satellite CENP-C CENP-A CENP-G CENP-H CENP-I Mis12 Piastra esterna: CENP-E CENP-F Dineina Mad’s Bub’s Dominio centrale CENP-B DNA α-satellit Dominio di appaiamento: INCEP Coesina CliP Le proteine costitutive del centromero Le proteine coinvolte nella funzionalità del centromero sono numerose e possono essere suddivise in due categorie: le proteine costitutive del centromero e le proteine accessorie del centromero. Tra le prime vi è un piccolo gruppo di proteine centromeriche molto importanti in quanto necessarie al corretto assemblaggio del cinetocore. Queste proteine, che sono associate alcentromero per tutta la durata del ciclo cellulare, si assemblano in maniera gerarchica e codipendente permettendo sia la formazione del cinetocore che la determinazione epigenetica e quindi la funzione e la propagazione dei centromeri. Tali proteine sono: CENP-A, CENP-B, CENP-C, CENP-H, CENP-I e Mis12.

Il dominio di appaiamento Le Chromosomal Passenger Proteins (CP) sono un gruppo di proteine centromeriche accessorie, che si associano transitoriamente con il centromero. Esse sono implicate nella coesione tra cromatidi fratelli e nel coordinamento degli eventi che coinvolgono i cromosomi e il citoscheletro durante la mitosi. Durante la profase le CP si accumulano lungo i cromosomi in via di condensazione e con il procedere della mitosi si concentrano nella parte interna del centromero. Successivamente si ritrovano nella parte interna della piastra metafasica per poi separarsi dai cromosomi quando questi segregano durante l’anafase; durante la citodieresi, le CP rimangono localizzate nella parte centrale del fuso mitotico. Attualmente sono note sei proteine CP: INCENP (Inner Centromeric Protein), Aurora-B, Survivina, Borealina, CSC-1 (Chromosome Segregation and Cytokinesis defective -1) e TD-60 (Telophase Disk - 60).

La cromatina centromerica può essere suddivisa in due parti: la “cromatina centrica” e la “cromatina pericentrica”. La distinzione è basata sulla presenza/assenza della proteina centromerica CENP-A. Tale proteina, che è una variante dell’istone H3, determina la formazione di nucleosomi con caratteristiche peculiari. Infatti, la cromatina centrica, è presente nel sito in cui si assembla il cinetocore, ed è costituita da nucleosomi contenenti CENP-A alternati ad altri che presentano l’istone H3, mentre la cromatina pericentrica ha solo nucleosomi normali, cioé contenenti l’istone H3, e forma la cosiddetta eterocromatina, importante per la stabilizzazione e l’integrità del centromero. Il DNA centromerico è costituito da ripetizioni in tandem di piccole sequenze organizzate testa-coda. Nell’uomo il monomero ripetuto di DNA centromerico è lungo 171 bp ed è conosciuto come alfa-satellite. L’alfa-satellite è il tipo di sequenza maggiormente rappresentato nelle regioni centromeriche dei cromosomi umani e mostra dimensioni variabili (da circa 200 Kb a più di 4 Mb). L’alfa-satellite umano presenta una specifica sequenza di 17 bp, detta CENP-B box, una sequenza che è riconosciuta dalla proteina centromerica CENP-B

Modello di organizzazione del centromero La formazione del centromero è un processo complesso che consiste nell’organizzazione del DNA in cromatina centromerica tipica la quale si associa con proteine specifiche. Tre osservazioni suggeriscono che per la formazione dei centromeri non sono indispensabili sequenze specifiche ma che il meccanismo implicato è strettamente correlato a modificazioni epigenetiche: la sequenza ripetuta centromerica presente negli eucarioti superiori non è conservata in insetti, funghi, piante e neanche nei mammiferi; cromosomi isodicentrici, sebbene hanno due blocchi di sequenze alfa satelliti hanno un solo centromero attivo; la scoperta di neocentromeri analfoidi in Drosophila e nell’uomo ha confermato che cinetocori funzionali possono essere assemblati in una grande varietà di sequenze genomiche.

Sebbene, verosimilmente, qualsiasi sequenza di DNA può formare un centromero, è poco chiaro in che modo una sequenza può determinare la centromerizzazione. E’ possibile, comunque, che alcune strutture primarie possano più di altre determinare strutture secondarie e terziarie che costituirebbero lo scaffold del centromero. Numerosi meccanismi epigenetici noti sembrano essere coinvolti direttamente nella formazione del centromero modificando la struttura della cromatina. Tra tali meccanismi epigenetici ricordiamo: la metilazione dell’eterocromatina pericentromerica ricca di CpG; la deacetilazione degli istoni H3 e H4 nelle regione centromeriche e pericentromeriche; fosforilazione degli istoni H1 e H3 cionvolta nella compattazione della cromatina; i cambiamenti conformazionali di livello superiore della cromatina determinati dal legame tra il DNA centromerico e proteine centromeriche specifiche quali per esempio CENP-A, CENP-C.

Secondo tale modello la cromatina della regione di centromerizzazione presenta tratti contenenti nucleosomi con l’istone H3 alternati, in modo abbastanza regolare, con regioni contenenti nucleosomi con CENP-A (al posto di H3). Studi di immunoprecipitazione inoltre indicano che CENPC si localizza in corrispondenza dei nucleosomi contenenti CENP-A, quindi anche CENP-C occupa domini discontinui. Solo parte dei domini contenenti CENP-B colocalizza con CENP-A e CENP-C, suggerendo che CENP-B si lega alle CENP-Bbox sia nei domini di CENP-A che nei domini dell’istone H3. Come possiamo vedere osservando la figura, secondo tale modello, CENP-C è fondamentale per il legame con le fibre del fuso, ma non si lega direttamente ad esse, bensì con l’interposizione di altre proteine centromeriche. Infine, secondo tale modello nell’organizzazione del centromero, è fondamentale la conformazione spaziale (a forma di cilindro) che la cromatina assume determinata soprattutto da CENP-A e CENP-C.

Il cinetocore: il sito d'attacco per i microtubuli del fuso mitotico

COME E’ FATTO UN CINETOCORE? I cinetocori sono posizionati ai lati opposti della costrizione primaria, sulla faccia esterna del cromosoma. Al microscopio elettronico presentano una struttura a forma di disco trilaminare: due parti, la piastra esterna e quella interna, sono elettrondense, tra di loro si trova la terza parte, più chiara, di nm di spessore. La piastra interna è associata con la superfice dell'eterocromatina centromerica, mentre qualla esterna prende contatto con le fibre del fuso mitotico. Il cinetocore contiene proteine con funzione diversa. Alcune sono coinvolte nell’attività motoria e fondamentali per l’organizzazione strutturale come le proteine CENP (CENtromere Protein), mentre altre sono implicate nella regolazione della transizione metafaseanafase

COME E’ FATTO UN CINETOCORE?

Il complesso centromero-cinetocore è capace di svolgere funzioni essenziali in differenti aspetti della mitosi e della meiosi: -è responsabile dell’appaiamento dei cromatidi fratelli, -rappresenta il sito d'attacco per i microtubuli del fuso mitotico, -controlla la transizione metafase-anafase nel ciclo cellulare regolando il movimento dei cromosomi.

Il corretto orientamento dei cromatidi fratelli e la segregazione degli stessi durante l'anafase sono determinati dal legame dell’estremità positiva (plus-end) dei microtubuli del fuso mitotico, provenienti dai poli opposti della cellula, alla piastra esterna del cinetocore (che contiene proteine importanti per il movimento dei cromosomi quali CENP-E e la dineina). In genere i cinetocori sono in grado di legare dai 10 ai 45 microtubuli.

A CHE SERVE IL FUSO MITOTICO? COME SI FORMA? COME FUNZIONA? COME SI ALLINEANO I CENTROSOMI? COME SI SEPARANO I CENTROSOMI? COME I MICROTUBULI SI LEGANO AI CROMOSOMI? COME VENGONO ‘AGGANCIATI’ I CROMOSOMI? COME SI MUOVONO I CROMOSOMI? COME SI SEPARANO I CROMATIDI?

I motori proteici

PRINCIPALI TIPI DI MIOSINE

ATTIVAZIONE DELLA MIOSINA

FUNZIONI DELLE MIOSINE

MECCANISMO DI FUNZIONAMENTO DELLA MIOSINA

REM NMR CHINESINE E DINEINE

PROPRIETA’ DELLE CHINESINE passo = 8 nmforza = 6 pN 3 tipi: N - motore N-terminale >>> estremità + M - motore centrale >>> estremità + C - motore C terminale >>> estremità - 2 classi:chinesine citosoliche KIF1A, KIF1B chinesine del fusoCENP-E, ncd, BimC

PROPRIETA’ DELLE DINEINE peso molecolare elevato funzionano insieme a MBP 2 classi:dineine citosoliche dineine dell’assonema