Applicazioni di Spettroscopia UV-Vis nell’Analisi Farmaceutica

1) DETERMINAZIONE DELLA FUROSEMIDE (diuretico) IN FIALA DI LASIX 1) Il contenuto di una fiala di furosemide, contenente 20 mg di farmaco, si trasferisce in un matraccio tarato da 100 ml 2) Si aggiunge una soluzione di NaOH 0,1 M preparata di fresco 3) Si agita bene per portare la sostanza in soluzione e si porta a volume 4) Si preleva una porzione dell’estratto par a 5 ml, si trasferisce in un altro matraccio e si porta al volume di 50 ml con NaOH 0,1 M 5) Si misura l’assorbanza dell’estratto diluito alla lunghezza d’onda di 271 nm (red-shift banda B) Il valore di A (1%, 1 cm) in soluzione di NaOH 0,1 M è 580. Diluizione ------ 5 → 50 ml (diluito 10 volte) Amisurata → 1,21 Determino quindi la % di Furosemide a partire dagli iniziali 20 mg (0,02 g):

2) DETERMINAZIONE DEL pKa DI UN GRUPPO IONIZZABILE Prendiamo in considerazione la FENILEFRINA (simpaticomimetico) Il grado di ionizzazione influenza l’assorbimento di questa molecola, che contiene gruppi ionizzabili, quali i gruppi OH e NH. In questa caso, in ambiente alcalino prevale la forma Basica , la cui λmax = 292 (ε = 182) ; In ambiente acido prevale invece la forma Acida , la cui λmax = 273 (ε = 110) A questo punto si devono determinare: 1) l’assorbanza della specie acida (Aacido) 2) l’assorbanza della specie basica (Abasica) 3) l’assorbanza di un tampone a pH noto (Atampone) Conoscendo questi dati posso determinare il pKa della molecola dalla formula: La lunghezza d’onda alla quale viene effettuata la determinazione viene accuratamente scelta, e in particolare si sceglie la lunghezza d’onda alla quale (Abasico – Aacido) è massima. Il pH del tampone, invece, viene scelto conoscendo più o meno l’ordine di grandezza del pKa. Più precisamente il pH viene scelto in modo che sia ± 1 unità rispetto al valore del pKa Determinazioni accurate si fanno ripetendo le letture a valori di pH vicini. Nel caso della fenilefrina: λ = 292 nm →è la lunghezza d’onda alla quale l’assorbanza della forma acida è trascurabile Abasica (NaOH 0,1 N) = 1,224 Aacida (HCl 0,1 N) = 0,02 Atampone (pH 8,5) = 0,349 base acido Abasico Aacido

3) DETERMINAZIONE DEL COEFFICIENTE DI RIPARTIZIONE DI UN FARMACO Proprietà fondamentale, il coefficiente di ripartizione (P) indica la distribuzione di farmaco tra due liquidi immiscibili tra loro e permette perciò di valutare l’assorbimento e la distribuzione del farmaco nell’organismo. Dipende dalla temperatura e viene espresso come: Tuttavia in genere l‘equazione per la definizione del coefficiente di ripartizione P può essere espressa anche in forma logaritmica, questo per poter confrontare facilmente anche valori di P molto diversi: Se > 1 il farmaco è lipofilo e diffonde facilmente Se < 1 il farmaco è idrofilo e non diffonde facilmente Ad esempio, se P = 10-4 parliamo di una sostanza poco lipofila. Se P = 102 parliamo invece di una sostanza molto lipofila La misurazione del coefficiente di ripartizione si basa sull’impiego di separatori che possono essere attivati manualmente o meccanicamente; in questo caso è però importante: ♥ la termostatazione del sistema (visto che P dipende dalla temperatura) ♥ l’equilibrazione preventiva delle due fasi (nel caso i due liquidi siano parzialmente miscibili) ♥ la messa a punto di un metodo analitico per il dosaggio del farmaco Su quest’ultimo punto diciamo che la determinazione del farmaco nelle due fasi può essere effettuata per via spettroscopica, giacché sappiamo che l’ Assorbanza di una soluzione è proporzionale alla concentrazione dell’analita in essa disciolto. Praticamente si procede aggiungendo il farmaco alle due fasi e agitando; quindi si effettua la separazione delle fasi e si dosa il farmaco; Dai valori ottenuti ricavo P e log P. Per quanto riguarda la scelta delle due fasi, questa va considerata alla luce del fine che si vuole raggiungere misurando il coefficiente di ripartizione. Lo scopo è quello di correlare un parametro chimico fisico con l’assorbimento e la ripartizione del farmaco nell’organismo, per cui la scelta della coppia di solventi deve essere tale da simulare le condizioni in cui si trova il farmaco all’interno dell’organismo (compartimento che in genere ha una componente lipofila e una idrofila) Una delle due fasi sarà perciò lipidica (solventi organici o oli), mentre l’altra sarà acquosa (acqua o soluzione tampone); la coppia più usata è n-ottanolo/acqua. In definitiva l’entità dell’assorbimento di un farmaco dipende dal suo pKa (e pH del mezzo) e dalla sua lipofilia.

IL COLORE: Che cos’è e come lo vediamo

La percezione del colore: dallo spettrofotometro alla strumentazione umana! Sensazione: -processo elementare mediante cui il nostro organismo riceve energia fisica da ambiente esterno; -processo passivo che avviene nell’organo di senso (e.g. occhio), senza coinvolgimento cosciente Percezione: -Processo evoluto mediante il cui organizziamo ed interpretiamo la sensazione -processo attivo che avviene nel cervello che coinvolge sensazione di oggetto esterno ed esperienza

Sensazione ACQUISIZIONE dei DATI Un paragone con la strumentazione… ELABORATORE SOLE OGGETTO OCCHIO CERVELLO Percezione: ELABORAZIONE dei DATI

IL COLORE: Che cos’è

Il Primo modello colorimetrico: Che cos’è il colore? Il Primo modello colorimetrico: Isaac Newton (1642-1727) Un fascio di luce bianca viene scomposto da un prisma in fasci di luce monocromatica, cioè di lunghezze d’onda fissata (la luce è un’onda elettromagnetica) Luce Visibile (Spettro Visibile)

Che cos’è il colore? La luce che tipicamente vediamo tutti i giorni non corrisponde mai ad una sola lunghezza d'onda ma e' una combinazione di contributi a diverse lunghezze d'onda. La rappresentazione dei contributi (Energia) dei vari componenti alle diverse lunghezze d'onda viene detta Spettro. Un colore corrispondente ad una radiazione elettromagnetica ad una sola frequenza viene detto colore puro

Che cos’è il colore? Colore: Non è una proprietà fisica ma piuttosto una proprietà psicofisica Sensazione (ottica): -effetto determinato da un'onda elettromagnetica che colpisce alcune strutture del nostro sistema visivo -effetto variabile, a seconda della lunghezza d’onda della luce che colpisce l’occhio Percezione (ottica): -come effetto percettivo, gli esseri umani sono in grado di percepire la luce quando la lunghezza dell'onda elettromagnetica e' compresa tra 350nm -780nm (sopra i 780nm si trovano gli infrarossi e sotto i 350nm si trovano gli ultravioletti). -Lo spettro del visibile corrisponde quindi alle frequenze comprese tra 384THz -857THz. 780 nm 384THz 350 nm 875 THz

IL COLORE: come lo vediamo (esternamente)

Come vediamo? Esternamente (stimolo: luce) La nostra percezione di un oggetto colorato può avvenire secondo due differenti processi, a seconda che l'oggetto sia una sorgente di luce oppure sia illuminato da una sorgente di luce esterna. 1. Nel primo caso, la luce che noi percepiamo e' quella irradiata dall'oggetto. 2. Nel secondo caso, la luce che noi percepiamo e' quella riflessa dall'oggetto. Il colore che noi attribuiamo all'oggetto corrisponde al colore della luce che lo illumina a cui si sottrae il colore assorbito dall'oggetto.

Come vediamo? La maggior parte della luce che noi vediamo è luce riflessa da oggetti Tipiche fonti di luce sono: il sole, le lampadine etc, che emettono in un ampio spettro della radiazione elettromagnetica fra 400–700 nm Un oggetto rosso è un oggetto che riflette la luce di lunghezza d’onda corrispondente al rosso e assorbe tutte le altre

Come vediamo? Iw Lw Rw © Stephen E. Palmer, 2002

Come vediamo? Esempi: La mela rossa, il Limone giallo! La mela è rossa: il colore maggiormente riflesso è il rosso

Come vediamo? Il colore che vediamo Un oggetto bianco riflette tutte le lunghezze d’onda Un oggetto nero assorbe tutte le lunghezze d’onda

IL COLORE: come lo vediamo (internamente)

Come vediamo? Internamente (senso: vista) S M L Ancora un paragone con la strumentazione… Spettrofotometro a serie di diodi: Ogni fotodiodo allineato misura la particolare banda di radiazione inviatagli dall’elemento disperdente Noi NON abbiamo un fotorecettore per ogni particolare banda ma “solo” 3 fotorecettori (3 CONI) S M L

Il problema dell’univarianza Come vediamo? Il problema dell’univarianza Sebbene sa:1) assorbire in modo diverso lunghezze d’onda diverse; 2)contare il numero di fotoni che assorbe

Il problema dell’univarianza Come vediamo? Il problema dell’univarianza NON sa: distinguere una lunghezza d’onda da un’altra! Quindi disponendo solo di un fotorecettore non è possibile discriminare fra lunghezze d’onda diverse ovvero discriminare fra colori diversi Un infinito insieme di combinazioni di intensità e lunghezza d’onda possono produrre una identica risposta da parte di UN tipo di fotorecettore

Il problema dell’univarianza: non si possono percepire i colori utilizzando un solo tipo di fotorecettori. Risoluzione: Disponendo di tre diversi tipi di coni è per noi possibile distinguere fra radiazioni luminose di lunghezze d’onda diverse e quindi VEDERE I COLORI!!! Ambiguità risolta!!

…per capire quanto questo sia importante: Situazione reale Situazione ipotetica se non si fosse sovrapposizione Situazione ipotetica se ci si fosse sovrapposizione ma con assorbanza uguale

…per capire quanto questo sia importante:

….Tuttavia esiste ancora un problema……… Il Metemerismo: Combinazioni di lunghezze d’onda diverse che appaiono identiche. In generale il termine si riferisce a qualsiasi coppia di stimoli che sono percepiti essere identici nonostante le differenze a livello fisico Esempio: prendiamo una luce verde e una luce rossa ed illuminiamo con queste un pezzo di carta bianco in modo che un mix di luce verde e rossa sia riflesso dalla carta indietro al nostro occhio. Ammettiamo anche che il cono M produca 80 unità di risposta per la luce verde e 40 per quella rossa cos’ come che il cono L produca 40 unità di risposta per la luce verde e 80 per quella rossa. (N.B. In questo esempio non consideriamo i coni S). Se assumiamo che si possano sommare insieme le risposte di ogni cono, entrambi (L e M) coni producono 120 unità di risposta

Il Metemerismo

Il Metemerismo Ricordiamo che il resto del sistema nervoso conosce solo la risposta fornita dai coni ed ignora la vera fonte di illuminazione (La percezione del colore è nel cervello!!!!!) Detto ciò risulta chiaro che la risposta dei coni nella situazione sopra presentata risulta indistinguibile da quella prodotta se ad illuminare il foglio di carta fosse stata un appropriata luce GIALLA Due importanti avvertimenti: Mischiare insieme le lunghezze d’onda non muta le lunghezze d’onda a livello fisico! Per ottenere da una luce rossa e una verde un giallo perfetto si deve semplicemente scegliere con accuratezza la giusta quantità di rosso e verde.

I MODELLI CROMATICI Per rappresentare opportunamente i fenomeni di percezione cromatica, i modelli cromatici vengono divisi in due categorie: modelli Additivi modelli Sottrattivi Combinazioni colorimetriche col metodo ADDITIVO (miscuglio di luci) Se una luce A e una B sono riflesse da una certa superficie verso l’occhio, a livello percettivo l’effetto di queste due radiazioni si sommano insieme Esempio : TV e Monitor Combinazioni colorimetriche col metodo SOTTRATTIVO (dovute per esempio all’uso di pigmenti) se i pigmenti A e B si mischiano, una certa quantità della luce riflessa da una superficie sarà sottratta da A, un po’ da B e solo la quantità rimanente darà un contributo alla percezione dei colori Esempio: Stampante 1 pixel = 3 fosfori R,G,B, illuminati con intensità variabile

Miscela di Colori Sottrativa Show subtractive color mixture concept (Figure 5.7).

Miscela di Colori Additiva rosso verde blu giallo magenta cyan bianco Show additive color mixture concept (Figure 5.8).

Additive Color Mixture with Paints Georger’s seurat: La Parade Show example of art with additive color mixture (Figure 5.9). Visto da vicino il volto dell’uomo è formato da tanti punti di colore innaturale per una faccia

Chi sono i responsabili di tutto ciò? In realtà La luce è trasdotta da due tipi di fotorecettori: i coni (3 tipi) e i bastoncelli (1 tipo) I fotorecettori sono strutture che, quando vengono colpite dalla radiazione elettromagnetica visibile, generano impulsi elettrici. Gli impulsi elettrici, attraverso il nervo ottico vengono trasmessi al cervello. Il segmento esterno contiene sostanze chimiche fotosensibili Il segmento esterno contiene sostanze chimiche fotosensibili

Dove sono posizionati Coni e Bastoncelli nell’Occhio Umano? nervo ottico fovea (“pellicola fotosensibile!”) (“grana della pellicola!”)

Come sono distribuiti Coni e Bastoncelli nella Fovea della Retina? Show diagram of photoreceptor density across the retina (Figure 2.9). I bastoncelli sono localizzati prevalentemente su una corona circolare attorno alla foveae provvedono alla visione scotopicaacromatica, fornendo informazioni sulla sola intensita'luminosa (non sul colore) ed in presenza di poca luce (visione notturna). In presenza di forte intensita'luminosa il funzionamento dei bastoncelli e' inibito. 􀁜I coni sono in numero inferiore rispetto ai bastoncelli e sono localizzati tutt'intorno alla fovea. Sono responsabili della visione fotopicacromatica fornendo informazioni in presenza di maggiore intensita'luminosa.

Com’è Organizzato il sistema visivo nell’uomo? La struttura della retina: 120 milioni di bastoncelli 6 milioni di coni Nervo ottico Assoni delle cellule gangliari retiniche Zoom Solo 1 milione di cellule gangliari Al centro della fovea questo rapporto scala sino a 1:1 Cellule gangliari retiniche Cellule orizzontali Strato sinaptico interno Strato sinaptico esterno

Risposta e Sensibilità dei Coni e Bastoncelli La risposta dei ricettori non e del tipo on/off ma graduale (ADATTAMENTO)!!! CONI BASTONCELLI Perchè un cono si ecciti e richiesto un certo livello di luce. I bastoncelli sono sensibili anche per bassi livelli di luminosità (raggiungono il loro massimo a livelli moderati di luminosità). Permettono visione dei colori Sono cechi al colore. Sono collegati singolarmente (ognuno dei 3 tipi) alle fibre nervose Piu bastoncelli sono collegati alla stessa fibra nervosa. (basta pochissima luce per eccitarli) Sono responsabili della visione fotopicacromatica fornendo informazioni in presenza di maggiore intensita'luminosa. provvedono alla visione scotopicaacromatica, fornendo informazioni sulla sola intensita‘ luminosa (non sul colore) ed in presenza di poca luce (visione notturna). In presenza di forte intensita‘ luminosa il funzionamento dei bastoncelli e' inibito. I coni sono in numero inferiore rispetto ai bastoncelli e sono localizzati al centro della fovea. I bastoncelli sono localizzati prevalentemente su una corona circolare attorno alla fovea

La visione fotopica (luce visione) Coni: Fotorecettori specializzati per la visione diurna (FOTOPICA), la visione dei dettagli fini e LA PERCEZIONE DEL COLORE La visione fotopica (luce visione) Sono coinvolti i coni nella regione centrale della retina, ed i bastoncelli alla periferia la massima sensibilità spettrale è a 555 nm.

Visione scotopica (oscurità visione) Bastoncelli: Fotorecettori specializzati per la visione notturna (scotopica) Visione scotopica (oscurità visione) Coinvolge i bastoncelli, l’immagine si forma alla periferia della retina,il picco di sensibilità è a 505 nm. Le curve non sono in scala perché il picco della curva scotopica è 1000 volte più alto per fotosensibilità dei bastoncelli. Tutti i bastoncelli hanno la medesima sensibilità alle lunghezze d’onda, perciò tramite essi la discriminazione dei colori risulta essere impossibile!!!

…..Questo è il motivo per cui i colori non si vedono in una scena con una illuminazione molto debole Show moonlit world appearing to be drained of color (Figure 5.3).

Ma cosa avviene a livello molecolare? ~ 1.7·10 3 dischi / bastoncello ~ 1.0·10 8 bastoncelli / retina ~ 6.5·10 6 coni/retina ~ 1.5·10 3 rodopsine/disco

h Vitamina A o retinale Precursore: -carotene Nella mucosa intestinale, degradato a all-trans-retinolo Trasportato nel sangue al fegato legato a retinol-binding protein Isomerizza a 11-cis-retinolo Ridotto (deidrogenasi) a 11-cis-retinale La luce trasforma 11-cis-retinale in all-trans-retinale h all-trans-retinale

Vitamina A (retinale) e Rodopsina La rodopsina contiene un sito attivo per 11-cis-retinale ma non per all-trans-retinale L’isomerizzazione di 11-cis-retinale a all-trans-retinale causa il cambiamento conformazionale della rodopsina

Processo di “sbiancamento” dei pigmenti dalla luce!!!!! Movimento atomico Impulso elettrico Nel processo di “sbiancamento” dei pigmenti si producono sostanze chimiche che agiscono sulle terminazioni nervose Più alta è l’intensità luminosa (numero fotoni) sui fotorecettori, più alto il grado di scolorimento dei pigmenti visivi, più forte la sensazione di luminosità inviata al cervello

Dai colori della Luce ad un Mondo di Colori! Il grande privilegio di vedere i colori è riservato all’uomo ed alcune specie di animali (uccelli, rettili, pesci, insetti) ma non alla stragrande maggioranza dei mammiferi dove è rudimentale o assente!! Gli esperimenti sugli animali aiutano a comprendere la visione dei colori negli umani: I fiori mandano avvisi attraverso i colori per le api proponendo uno scambo di cibo per sesso (per l’impollinazione) Alcuni pesci tropicali e i tucani hanno parte del loro corpo vivamente colorata come segnale sessuale

5.24 Black-eyed Susans as humans see them (a) and as honeybees see them (b) wolfe-fig-05-24-0.jpg (Macchina fotografica equipaggiata per rivelare solo luce UV “vede” patterns invisibili a noi!)

Animal Coloration Show animals that use colors as an advertisement to potential mates (Figure 5.25).

L A VISIONE: E ADESSO DIVERTIAMOCI!!

Opponent Processes (cont’d) Post-immagine: Una immagine visiva che è ancora visibile dopo che lo stimolo è scomparso Questo è un buon metodo per vedere l’opponenza dei colori in azione

Colori complementari

Opponent Processes (cont’d) Post-Immagine negativa: Una post immagine la cui polarità è opposta a quella dell’immagine di partenza. La luce produce post immagini nere. I colori post immagini complementari: rosso produce verde; giallo produce blu

Complementary after-images If you fixate a strongly-coloured image on a constant region of the retina, the sensitivity of the absorbing cones will be temporarily reduced and they will respond to the incident light much less. It’s very important that you fixate the image. The treshold of sensibility of your blue cones are increased in this part.

Complementary after-images If you fixate a strongly-coloured image on a constant region of the retina, the sensitivity of the absorbing cones will be temporarily reduced and they will respond to the incident light much less. It’s very important that you fixate the image. The treshold of sensibility of your blue cones are increased in this part.

Negative Afterimage Show negative afterimage (Figure 5.14).

Bloj, Kersten, and Hurlbert Experiment Show Bloj et al. experiment about assumptions of physics influencing color perception (Figure 5.21).

AMBIGUITA’ VISIVE GESTALT “Nella percezione visiva, il tutto è più della somma delle sue parti” (Gestalt)

Face of Mae West which may be used as an apartement, circa 1935 Salvador Dalì Face of Mae West which may be used as an apartement, circa 1935 S.Dalì, 1935

Ambiguità

This type of reversible figure concerns the meaningful content of what is interpreted by your brain from the same static image. Your perception of each figure tends to remain stable until you attend to different regions or contours. Certain regions and contours tend to favor one perception, others the alternative. Even though certain contours in this figure are ambiguous, your perceptual change in this case does not involve a figure/ground reversal. “Immagine bistabile” “Immagine bistabile”

Slave market with the disappearing bust of Voltaire, 1940 Salvador Dalì, Slave market with the disappearing bust of Voltaire, 1940 Salvador Dalì, Slave market with the disappearing bust of Voltaire, 1940

Salvador Dali The Great Paranoiac, 1936 AMBIGUITA’ VISIVA

Head of a woman in form of a battle, 1936 Salvador Dali Head of a woman in form of a battle, 1936 Salvador Dali Head of a woman in form of a battle, 1936 Salvador Dali Head of a woman in form of a battle, 1936

Un semplice test: quale numero? (Ishihara) DALTONISMO Un semplice test: quale numero? (Ishihara) Visione normale: 5; Daltonismo per rosso/verde: 2

Altri test: quale numero? DALTONISMO Altri test: quale numero? http://www.toledo-bend.com/colorblind/Ishihara.html Chi non riesce a distinguere il rosso e il verde non vede i numeri: 29, 45, 6, 8 (Ishihara)