per accrescersi i microrganismi hanno bisogno di trarre dall’ambiente esterno i nutrienti o nutriliti i microrganismi sono straordinariamente diversi nelle loro proprietà fiisiologiche e, quindi, nelle loro richieste nutrizionali la composizione chimica delle cellule ci dà indicazione su quali siano le principali esigenze nutrizionali PRINCIPI DELLA NUTRIZIONE MICROBICA

Elemento% peso secco C50 O20 N14 H 6 P 3 S 1 K 1 Ca 0.5 Mg 0.5 Cl 0.5 Fe 0.2 Mn, Co, Cu, Ni, Mo, Zn in tracce Composizione elementare della cellula microbica (E. coli)

Fototrofia Chemiotrofia ADP + P i luce ATP + H 2 O Organismi fotosintetici (Alcuni batteri, alghe verdi, piante) Organismi chemiosintetici X red + A ox X ox + A red X red inorganico organico Litotrofia Organotrofia ChemiolitotrofiaChemioorganotrofia (Alcuni batteri) (Batteri, Funghi, Animali) C-autotrofi C-eterototrofi FABBISOGNO ENERGETICO

Funghi R RA F R = respirazioneRA = respirazione anaerobica F= fermentazione

Chemioorganotrofi Ossidazione incompleta del substrato (carboidrati, amminoacidi, basi azotate) ATP: fosforilazione a livello del substrato 2 ATP/mole di glucosio Anaerobi stretti Anaerobi facoltativi Anaerobi aerotolleranti Ossidazione completa del substrato (carboidrati, amminoacidi, basi azotate, acidi grassi) ATP: fosforilazione a livello del substrato ( 2 ATP/mole di glucosio) e fosforilazione ossidativa ( moli ATP/mole di glucosio) Aerobi Anaerobi facoltativi Anaerobi stretti (resp.anaerobica) Fermentazione Substrato organico flusso di e- flusso del C prodotto organico Substrato organico flusso di e- flusso del C CO 2 O2O2 NO - 3 SO 2- 4 CO - 3 Respirazione

C-autotrofi : sono in grado di organicare il carbonio usano CO 2 come fonte di C CO 2 + 4H CH 2 O + H 2 O C- eterotrofi : non sono in grado di organicare il carbonio devono utilizzare un composto organico del carbonio come fonte di carbonio FONTE DI CARBONIO

Nel materiale cellulare N e S sono presenti come gruppi –NH 2, -SH. Nitrati e solfati, fonti ossidate di N e S, devono essere portati al livello di ossidazione al quale si trovano nel materiale cellulare: NO HNH 3 + 2H 2 O + OH - SO H S H 2 O Fonti di azoto ridotte: sali di ammonio o amminoacidi Fonte di zolfo ridotta: cisteina FONTI DI AZOTO E ZOLFO

Sintetici o definiti : composizione nota dal punto di vista qualitativo e quantitativo glucosio (10 g) NH 4 H 2 PO 4 (1 g) NaCl (5 g) MgSO 4* 7H 2 O (0.2 g) K 2 HPO 4 (0.2 g) H 2 O q.b. a 1 l Ricchi-complessi : composizione chimica non nota glucosio (10 g) estratto di lievito (10 g) peptone (5 g) H 2 O q.b. a 1 l Peptone: prodotto della digestione di carne, caseina, gelatina (fonte di N) Estratto di lievito: estratto di cellule di S. cerevisiae (fonte di vitamine del gruppo B, di N e di composti del carbonio) Terreni di coltura: sono soluzioni liquide (o solidificate) contenenti sostanze nutritive su cui è possibile far crescere le cellule microbiche, si dividono in:

Terreni solidi e liquidi Terreni liquidi (brodi) Terreni solidi (come liquidi + agar) coltivazione isolamento Agar agente solidificante di natura polisaccaridica (gelifica a temperature < 45 °C)

Reazione del Maillard: a temperature elevate (ad es: durante la sterilizzazione del terreno), il glucosio reagisce con l’-NH 2 degli aa. dando luogo alla formazione di N-glicosilammina, a ciò si accompagna una diminuzione delle proprietà nutritive del terreno Evitare la reazione del Maillard

Reazione di Maillard

Preparazione di un terreno solido: l’agente solidificante Agar agente solidificante di natura polisaccaridica (gelifica a temperature < 45 °C). L’agar, insolubile a temperatura ambiente, si scioglie durante la sterilizzazione dei terreni in autoclave.

Preparazione di un terreno solido: le capsule o piastre Petri Il terreno contenente agar sciolto (50 °C) è versato nella capsula Quando la la temperatura si abbassa il terreno gelifica (passaggio sol > gel)

Inoculare un terreno solido: Lo striscio: ansa sterile

The famous tropical sunset scene by Nobel Prize-winner Dr. Roger Tsien, University of California San Diego, USA. This image was created using transgenic bacteria expressing fluorescent protein genes. Microbial Art

Coltura pura = contenente un solo tipo di microrganismo Isolamento in terreni solidi (piastre Petri) Coltivazione in terreni liquidi (beute, fermentatori) (in microbiologia industriale sinonimo di fermentazione) Conservazione liofilizzazione, basse temperature

Appl Environ Microbiol.Appl Environ Microbiol Dec 15;80(24): A hidden pitfall in the preparation of agar media undermines microorganism cultivability Microbiologists have been using agar growth medium for over 120 years. It revolutionized microbiology in the 1890s when microbiologists were seeking effective methods to isolate microorganisms, which led to the successful cultivation of microorganisms as single clones. But there has been a disparity between total cell counts and cultivable cell counts on plates, often referred to as the "great plate count anomaly," that has long been a phenomenon that still remains unsolved. Here, we report that a common practice microbiologists have employed to prepare agar medium has a hidden pitfall: when phosphate was autoclaved together with agar to prepare solid growth media (PT medium), total colony counts were remarkably lower than those grown on agar plates in which phosphate and agar were separately autoclaved and mixed right before solidification (PS medium) Chemical analysis of PT agar plates suggested that hydrogen peroxide was contributing to growth inhibition

Formulazione del terreno di coltura Conoscenza della stechiometria della crescita e della formazione del prodotto Fonte di C ed energia + Fonte di N + Fonti minerali+ O 2 + richieste specifiche* Biomassa+ prodotto + CO 2 + H 2 O + calore Nel caso di un chemioorganotrofo aerobio : * Se auxotrofo aCxHyOz + bNuHwOw + Sali + cO 2 dC  H  O  N  + eCmHnOpNr + fH 2 O +gCO 2 +  H

Mezzo di coltura formulato per sostenere la produzione di 30 g/l di lievito: Componenti: C 6 H 12 O 6 (NH 4 ) 2 SO 4 KH 2 PO 4 MgSO 4 Tracce Concentrazione [g/l]: M aCxHyOz + bNuHwOw + Sali + cO 2 dC  H  O  N  + eCmHnOpNr + fH 2 O +gCO 2 +  H La stechiometria può essere la seguente, considerando trascurabili i prodotti diversi dalla biomassa: 1.

Per quanto riguarda la biomassa ci si può rifare alla composizione elementare, dove troviamo valori medi: 2.

3.Esempio di calcolo per quanto riguarda (NH 4 ) 2 SO 4 e C 6 H 12 O 6 Il glucosio è fonte di C e di energia, pertanto non può essere stimato dalla composizione elementare della biomassa. Il coefficiente di Resa (Yield) permette di conoscere la quantità di substrato necessaria ad ottenere una data quantità di biomassa: Y x/s =  x/  s (Kg Kg -1 )

Durante la coltivazione (fermentazione) occorre controllare: Temperatura: psicrofili (10-20 °C) mesofili (20-50 °C) termofili (50-70 °C) ipertermofili (> 70 °C) pH: uso di soluzioni tampone CaCO 3 pHstat ossigeno: aerobi anaerobi anaerobi facoltativi anaerobi aerotolleranti

A)Aerobi B) Anaerobi C) Anaerobi facoltativi D) Microaerofili E) Anaerobi aerotolleranti La superficie liquida è coperta da un tappo di agar contenente resazurrina, un indicatore redox (di colore rosa quando è ossidata, incolore quando ridotta). L’ossigeno penetra solo per un breve tratto all’interno del tubo per cui si crea un gradiente di [O 2 ]

Operazioni a valle Downstream processing Operazioni a monte Upstream processing SCELTA DEL CEPPO MIGLIORAMENTO DEL CEPPO

Terreno industriale : in genere complesso, non definito Caratteristiche: Basso costo Facile reperibilità Deve consentire la massima resa di prodotto Deve consentire la massima produttività Non deve causare problemi per quanto riguarda l’agitazione, l’aerazione ed il recupero

Alcuni esempi di terreni industriali:

Principali fonti di carbonio e azoto usate nell’industria fermentativa: Amido Melassi Siero di latte Olii Corn steep liquor Acque solfitiche Metanolo Idrocarburi Materiali lignocellulosici Ammoniaca Sali di ammonio Nitrati Urea Estratto di lievito Idrolizzati proteici Farina di soia Farina di pesce H 2 O, minerali, O 2 Altri componenti fondamentali: additivi (tamponi), antischiuma, induttori/inibitori, precursoriAltro: