CROMATOGRAFIA PER SCAMBIO IONICO Le molecole cariche interagiscono con dei gruppi funzionali che si trovano sulla fase stazionaria La forza del legame proteina-matrice dipende dalla carica netta della proteina La separazione delle molecole si basa sulle differenze di carica netta (per valori di pH definiti) delle diverse proteine FASE STAZIONARIA solida – gruppi carichi FASE MOBILE liquida Le matrici adoperate possono essere di polistirene, cellulosa, destrano ed agarosio

Effetti del pH sulla PROTEINA pI = 5.5 Proteinan+ Proteinan- 4 7 10 pH

Effetti del pH sulla PROTEINA pI = 8.5 Proteinan+ Proteinan- 4 7 10 pH

CROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICO Proteine cariche si legano alla superficie di RESINE dotate di GRUPPI IONICI di carica opposta Scambio cationico Scambio anionico Lo scambiatore cationico contiene delle cariche negative e i cationi sono attratti elettrostaticamente Lo scambiatore anionico contiene dei gruppi carichi positivamente in grado di legare ioni di carica negativa

Effetti del pH sulla resina scambiatrice Gruppo CARBOSSIMETILICO scambiatore debole di cationi (ridotto intervallo di utilizzo) R-CH2-COOH = R-CH2-COO- pKa ~ 4.5 Gruppo PROPILSOLFONICO scambiatore forte di cationi (ampio intervallo di utilizzo) R-CH2-CH2-CH2-SO3H = R-CH2-CH2-CH2-SO3- pKa < 1

Effetti del pH sulla resina scambiatrice Gruppo amminico terziario scambiatore debole di anioni (ridotto intervallo di utilizzo) R R | | R-CH2-N: = R-CH2-NH+ pKa ~ 8.5 Gruppo amminico quaternario scambiatore forte di anioni (ampio intervallo di utilizzo) R | R-CH2-N+-R

Cromatografia in Batch - - - - - - - -

Proteine con carica + Proteine con carica -

- Scambiatore - Proteine con carica + Proteine con carica -

- - - - - - - - - - Scambiatore Proteine con carica +

CENTRIFUGAZIONE - - Scambiatore Proteine con carica +

soluzione di lavaggio - - - - - - - - -

Soluzione salina concentrata - - - - - - - - -

Eluizione - - - - - - - -

_ _ _ _ _ _ + + + + + + R-CH2-COO- R-CH2-COO- R-CH2-COO- R-CH2-COO- R-CH2-COO- + + + R-CH2-COO-

Na+ Cl- Na+ Cl- Na+ Cl- R-CH2-COO- + + + + + + Cl- Na+ R-CH2-COO- Na+ R-CH2-COO- Na+ + + + Cl- R-CH2-COO- R-CH2-COO- R-CH2-COO-

Na+ Na+ Cl- Na+ Cl- Na+ Na+ R-CH2-COO- R-CH2-COO- Na+ Cl- Na+ R-CH2-COO- Na+ Cl- Cl- R-CH2-COO- Na+ Cl- Cl- Cl- + + + + + + R-CH2-COO- Na+ R-CH2-COO- Na+ Cl- Cl- Cl- Cl- Cl- Na+ Na+ Na+ Cl- Cl-

Cromatografia in Batch - - - - - - - -

Cromatografia su COLONNA

Eluizione a STEP

Eluizione a STEP [SALE]

Eluizione in gradiente [SALE]

TampB TampA Pompa peristaltica Colonna Formatore di gradiente Collettore di frazioni

TampB TampA Pompa peristaltica Colonna Formatore di gradiente Collettore di frazioni

TampB Pompa peristaltica Colonna Formatore di gradiente Collettore di frazioni

SCAMBIO IONICO VANTAGGI: Grande capacità di carico (grandi volumi) La proteina è eluita in un volume piccolo Limitata a molecole ionizzabili SVANTAGGI: Limitata a molecole ionizzabili Esecuzione in due tempi Eluizione in un tampone a pH e forza ionica diverso dal tampone iniziale

CROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICO PER SEPAPARE AMMINOACIDI Scambiatore cationico forte pH 1-2 (tutti gli aa si legano) Eluizione tramite aumento di pH e forza ionica: aa acidi (es aspartato e glutammato) aa neutri (es glicina e valina) aa basici (es lisina e arginina) Rivelazione tramite ninidrina

Ala-Gly-Asp-Phe-Arg-Gly COMPOSIZIONE IN AA Ala-Gly-Asp-Phe-Arg-Gly 110°C per 24h sotto vuoto in presenza di acido cloridrico 6M Idrolisi totale della proteina Asparagina e glutammina sono convertite nei rispettivi acidi cromatografia a scambio ionico eluzione in funzione del pH

RESINA: Scambiatore cationico forte pH 1-2 (tutti gli aa si legano) Eluizione tramite aumento di pH e forza ionica: aa acidi (es aspartato e glutammato) aa neutri (es glicina e valina) aa basici (es lisina e arginina) Rivelazione tramite ninidrina

La Ninidrina reagisce con gli amminoacidi presenti nell'eluato, formando un composto colorato L'intensità del composto colorato è direttamente proporzionale alla quantità di amminoacido presente Il tempo di ritenzione del picco identifica l'amminoacido dal punto di vista qualitativo, mentre l'area dello stesso è utilizzata per ricavarne la concentrazione Per ottenere un'accurata analisi, il sistema deve essere calibrato con una miscela di amminoacidi standard, da cui ricavare successivamente i dati relativi al campione