INTRODUZIONE I rodenticidi anticoagulanti sono sostanze molto diffuse nelle comuni pratiche di disinfestazione [1]. I derivati cumarinici sono i composti, appartenenti a questa categoria, più frequentemente utilizzati. L’avvelenamento accidentale o doloso di animali d’affezione e sinantropi con anticoagulanti può avvenire mediante il consumo diretto di esche avvelenate o di ratti avvelenati con anticoagulanti [2]. I rodenticidi anticoagulanti sono antagonisti della vitamina K. Il fegato è il principale organo di accumulo di queste sostanze e, quindi, rappresenta l’organo di elezione per una diagnosi corretta di avvelenamento. I più diffusi metodi analitici per la determinazione dei rodenticidi anticoagulanti negli organi sono basati sulla cromatografia liquida ad elevate prestazioni accoppiata alla rivelazione UV o fluorimetrica [3-5]. Tali metodi tuttavia non permettono la determinazione simultanea di più di cinque analiti. Tra le tecniche analitiche di conferma, in alternativa alla spettrometria di massa [6] che, pur offrendo elevate sensibilità, richiede una strumentazione costosa, per la determinazione analitica è stato messo a punto ed ottimizzato un metodo multiresiduale per la determinazione di otto anticoagulanti nelle esche rodenticide e nel fegato, mediante cromatografia liquida a fase inversa con rivelazione fluorimetrica. Di tale metodo sono stati valutati i principali parametri di validazione (linearità, esattezza, precisione, LOD e LOQ) secondo quanto prescritto nel Reg. 882/2004/CE. In accordo con quanto previsto dall’Ordinanza Ministeriale del 18/12/2008 (G.U. n. 13 del 17/01/2009), il presente lavoro si colloca tra i contributi sul ricorso alle indagini di laboratorio per la conferma di sospetto avvelenamento da rodenticidi anticoagulanti. ANALISI MULTIRESIDUALE DI RODENTICIDI ANTICOAGULANTI NELLE ESCHE E NEL FEGATO MEDIANTE CROMATOGRAFIA LIQUIDA E RIVELAZIONE FLUORIMETRICA Iammarino M. a, Haouet N. b, Lo Magro S. a, Nardiello D. a, Muscarella M. a a Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia e della Basilicata, Dipartimento di Chimica, Foggia b Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell’Umbria e delle Marche, Dipartimento di Sicurezza Alimentare, Perugia XII Congresso Nazionale S.I.Di.L.V Ottobre 2010 Magazzini del Cotone GENOVA MATERIALI E METODI 4 g di campione omogeneizzato sono estratti in vortex per 1 min con 40 mL di una miscela diclorometano/acetone (70/30 v/v). La miscela, filtrata su membrane Wathman 40, è purificata su cartucce STRATA SPE Al-N 500mg – 6ml (Phenomenex, USA) attivate con 5 ml di soluzione estraente. 2 ml di filtrato vengono caricati sulla cartuccia, che viene successivamente lavata con 1 ml di soluzione estraente e con 1 ml di miscela diclorometano/acetone (25/75 v/v). Gli analiti sono eluiti con 4 ml di una miscela metanolo/acido acetico glaciale (95/5 v/v). L’eluato è portato a secco in corrente di azoto, in bagnomaria a 60°C. Il residuo, ripreso con 1 ml di metanolo e filtrato con filtri Anotop 10 LC (0.2 µm, Whatman) è pronto per l’analisi HPLC. Apparecchiatura: Cromatografo liquido Agilent Technologies SL 1200 Series (Waldbronn, Germania) corredato di rivelatore fluorimetrico (modello G1321A). Reagenti: acetone, acqua per HPLC, metanolo per HPLC, diclorometano (Baker, Deventer, Olanda); acido acetico (Carlo Erba, Italia); standard analitici PESTANAL ® (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA). Soluzioni standard 1000 mg/L di brodifacoum, coumafouryl, difenacoum, flocoumafen in acetonitrile; bromadiolone, coumachlor, coumatetralyl e warfarin in metanolo. Condizioni cromatografiche: Colonna Phenomenex Luna C18 (250 mm × 4.6mm i.d., dimensione particelle: 5µm). Eluizione binaria in gradiente: A = acido acetico 0.25% in acqua; B = acido acetico 0.25% in metanolo, come riportato in Tabella 1. Flusso: 0.5 mL/min. Temperatura colonna: 25°C. Volume di iniezione: 20 µL. di eccitazione: 310 nm. di emissione: 390 nm.RISULTATI La metodica per la determinazione multiresiduale di otto anticoagulanti (bromadiolone, brodifacoum, coumachlor, coumafouryl, coumatetralyl, difenacoum, flocoumafen e warfarin) nel fegato e nelle esche rodenticide è stata ottimizzata sia in fase di preparazione e purificazione del campione, che in fase di separazione cromatografica. Gli studi sono stati condotti su campioni di fegato additivati a 5 mg/kg per ogni analita e su campioni di esche rodenticide. La metodica proposta risulta rapida (con un tempo di analisi complessivo inferiore a 90 min), economica e semplice. In Tabella 2 sono riportati i principali parametri di validazione valutati. Le rette di taratura sono state costruite iniettando 4 soluzioni standard alle concentrazioni di 2.5, 5.0, 10.0, 20.0 mg/L per ogni analita. La specificità del metodo è stata verificata iniettando 10 campioni di fegato e verificando assenza di interferenti nell’intorno del ± 2.5% del tempo di ritenzione degli analiti. La valutazione dell’accuratezza è stata effettuata mediante 6 prove ripetute su un campione di fegato additivato a 5 mg/kg per ogni analita. I risultati, in termini di recupero% per quanto riguarda l’esattezza, ed in termini di CV% per quanto riguarda la precisione, sono schematizzati in tabella 2. Le performances analitiche, unitamente alla semplicità e rapidità di esecuzione, rendono tale metodo particolarmente utile nella diagnosi di sospetto avvelenamento da rodenticidi anticoagulanti. In Figura 1 è riportato un cromatogramma relativo ad un’esca a base di Brodifacoum. In Figura 2 è mostrato il profilo cromatografico di una miscela standard 2.5 ppm (A) e di un campione di fegato positivo per Brodifacoum alla concentrazione di 2.2 ppm (B). Molecola Linearità (r 2 ) LOD µg/kg LOQ µg/kg Recupero (%) CV% Brodifacoum Bromadiolone Coumachlor Coumafouryl Coumatetralyl Difenacoum Flocoumafen Warfarin Tempo (min.) %A%B Tabella 1 – Gradiente di eluizione Tabella 2 – Principali parametri di validazione Figura 1 – Cromatogramma di un’esca a base di BrodifacoumFigura 2 – Cromatogramma di una miscela standard 2.5 ppm (A) e di un campione di fegato positivo per Brodifacoum alla concentrazione di 2.2 ppm (B) LEGENDA: 1 Coumafouryl; 2 Warfarin; 3 Coumachlor; 4 Coumatetralyl; 5 Bromadiolone; 6 Difenacoum; 7 Flocoumafen; 8 Brodifacoum. CONCLUSIONI Nel presente lavoro è stato messo a punto ed ottimizzato un metodo analitico per la determinazione di bromadiolone, brodifacoum, coumachlor, coumafouryl, coumatetralyl, difenacoum, flocoumafen e warfarin nel fegato e nelle esche rodenticide. Il metodo si basa sulla cromatografia liquida ad alte prestazioni con rivelazione fluorimetrica. Le condizioni di separazione cromatografica, accoppiate alla procedura di purificazione del campione, consentono una buona separazione degli otto analiti e un’elevata risoluzione da interferenti di matrice. Il metodo proposto si è dimostrato semplice, rapido, sensibile, economico e consente di ottenere una elevata riproducibilità di analisi. La valutazione delle principali prestazioni analitiche (linearità, esattezza, precisione, limiti di decisione e specificità), ha confermato l’applicabilità del metodo nelle indagini di laboratorio per la conferma di sospetto avvelenamento da rodenticidi anticoagulanti. BIBLIOGRAFIA [1] B. E. Watt, A. T. Proudfoot, S. M. Bradberry, J. A. Vale (2005). Toxicol Rev. 24, 259. [2] R. E. Marsh (1985). Pest Control 53, 20. [3] P. R. Ring, J. M. Bostick (2000). Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 22 (3), [4] Mi-Cong Jin, Xiao-Hong Chen, Yan Zhu (2007). Journal of Chromatography A 1155, 57–61. [5] F. Guan, A. Ishii, H. Seno, K. Watanabe, T. Kumazawa, O. Suzuki. (1999). Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 21, 179. [6] V. Vandenbroucke, N. Desmet, P. De Baccker, S. Croubels (2008). Journal of chromatography B 869,