MUTAZIONI CROMOSOMICHE STRUTTURALI: Cambiamenti nella morfologia del cromosoma DEL GENOMA: Cambiamenti nel numero di singoli cromosomi o di interi assetti

Cromosoma dicentrico + frammento Rottura; Interazione tra due estremità di taglio; Risaldatura: a) legittima = ripristino del cromosoma originale b) illegittima = cromosoma aberrante GLI EVENTI: prossimale al centromero distale al centromero a) legittima: b) illegittima: oppure Cromosoma dicentrico + frammento Traslocazione reciproca PERCHE’ I CAPI DI ROTTURA RISALDANO? Le estremità di taglio sono instabili perché non sono “protette” da sequenze telomeriche. Per questo vengono “processate” da attività enzimatiche dei sistemi di riparazione, oppure degradate da esonucleasi. COME? Il passo iniziale consiste sempre nell’interazione tra sequenze omologhe, anche brevi, seguendo poi meccanismi di tipo ricombinativo.

Come si formano: MECCANISMI DI INSORGENZA 2 ROTTURE sullo stesso cromosoma (con risaldatura) 1 ROTTURA Le rotture al doppio filamento del DNA (interruzioni nell’impalcatura zucchero-fosfato) tendono a risaldare, senza lasciare estremità di taglio libere.

Alla base della formazione di mutazioni strutturali vi è la produzione “accidentale” di rotture alla doppia elica: queste generano delle “estremità di taglio” libere ed instabili perché prive del capping telomerico presente nelle estremità naturali. Una volta prodotte, queste sono ‘disponibili’ per interazione reciproca che daranno origine a nuove riorganizzazioni attraverso risaldatura ad opera di DNA ligasi, in seguito a processi di riparazione specifici. 1a) 2) (in presenza di ripetizioni in tandem: 1’-1’’- 1’’’- 1’’’’ ) 1b) 3)

Possono anche essere originare attraverso crossing over in cellule somatiche tra sequenze di DNA ripetitivo presenti nel genoma: conseguenza di questi processi sono tipicamente le DELEZIONI e le DUPLICAZIONI.

Produzione di rotture al doppio filamento di DNA (Double Strand Break, DSB): 1) ROTTURA singola G1 G2 centromero (oppure la DSB risalda “a forcina” e poi replica); Frammento acentrico Le DSB presenti in G1, durante la fase S possono “replicare” insieme al cromosoma Anafase: (trazione in anafase) I FRAMMENTI ACENTRICI vengono sempre persi, dando luogo a DELEZIONI rottura secondaria! In caso di risaldatura tra estremi di rottura prossimali si forma una aberrazione instabile (isocromatidio) che ostacola la segregazione in anafase. Se non c’è risaldatura: delezione, per perdita del frammento acentrico.

2) Due ROTTURE sullo stesso cromosoma: a) sullo stesso braccio (paracentriche): STABILI = inversioni oppure INSTABILI = delezioni possiede il centromero A B C E D F A B C D E F A B C F D E + Cromosoma deleto (delezione interstiziale) + frammento circolare Inversione paracentrica possiede il centromero b) su bracci diversi (pericentriche): A D E F A C B D E F A B C D E F B C + Cromosoma ad anello + frammento Inversione pericentrica

Cromosoma dicentrico + frammento 2) Due ROTTURE su cromosomi diversi: STABILI oppure INSTABILI A B C D E M N O P A B C D P M N O E A B C D O M N + + + P E + t:3-9 9 t:9-3 3 traslocazione reciproca Cromosoma dicentrico + frammento 2’) a livello del Centromero: Traslocazione Robertsoniana (o fusione centrica)

1) Sindrome Down: Rb 14-21 L’assetto 2n= 46, X Y: -14 + t(14q21q) in cui è presente la duplicazione dell’intero cromosoma 21, risulta della fecondazione tra un gamete normale X (o Y) ed un gamete mutante: n= 23, Y (o X) -14 + t(14q21q).

Al momento di insorgenza della traslocazione Rb (nell’es Al momento di insorgenza della traslocazione Rb (nell’es., il cromosoma Rb 14-21) l’assetto è bilanciato ed il fenotipo è normale. L’individuo eterozigote per la traslocazione, con cariotipo 2n=45, Y: -14 + t(14q21q) è sano. Ma in meiosi, per effetto dell’assortimento indipendente, la probabilità di gameti sbilanciati con la duplicazione del 21 è pari al 25% . Questo individuo, eterozigote per la traslocazione, è ‘portatore sano’ della sindrome di Down.

Mutazioni strutturali STABILI o INSTABILI: rapporto 1:1 tra numero di filamenti di cromatina lineari e n. di centromeri presenti. la stabilità di un cromosoma è data dalla presenza di uno ed unico centromero (funzionale) per unità cromosomica (filamento di cromatina “aperto”, cioè con estremità telomeriche “libere”). Le mutazioni STABILI (delezioni, le inversioni e le traslocazioni) mantengono, nella nuova configurazione, le capacità di segregazione corretta e di equa ripartizione nelle cellule figlie dei cromosomi coinvolti: sono quindi ereditabili nelle generazioni successive.

La presenza aberrazioni strutturali instabili si rileva facilmente, mentre l’identificazione di quelle stabili (traslocazioni e inversioni) è più difficile Aberrazioni cromosomiche in linfociti umani (c-metafasi). 1 cromosoma ad anello; 1 dicentrico; 1 frammento circolare; 2 dicentrici. Esempi di aberrazioni cromosomiche stabili: traslocazioni reciproche (FISH chromosome painting).

Aberrazioni cromosomiche instabili: meccanica dell’instabilità +

FIGURA 11.1 Aberrazioni instabili e conseguenze meccaniche (eliminazione) sia in cellule somatiche che germinali. La comparsa di aberrazioni semplici (rotture), o complesse, come i dicentrici, ring, isocromatidi, è associata alla produzione di frammenti, responsabili della produzione di micronuclei (MN) all’interfase immediatamente successiva. Le aberrazioni instabili inoltre danno luogo a ulteriori riordinamenti alla mitosi successiva, in seguito a nuove frammentazioni dovute alla trazione dei ponti intercentomerici di cromatina, nelle anafasi seguenti.

Quali sono le conseguenze delle mutazioni strutturali per le cellule o per l’organismo? Le rotture DSB possono causare interruzione di sequenze codificanti e portare ad inattivazione del gene. Se comportano alterazione nel numero di geni/cromosomi causano SBILANCIAMENTI nel dosaggio genico: Incompatibilità con la sopravvivenza di sbilanciamenti (ipo- e iper- varianti) provocati da perdita di porzioni del genoma (frammenti cromosomici=delezioni ) o dall’acquisto di ulteriori copie (duplicazioni). 3) Se comportano cambiamento di posizione di parti del cromosoma: Effetto di posizione (traslocazioni) = inattivazione per eterocromatizzazione; Formazione di nuovi geni ricombinanti (es. cromosoma Philadelphia; emoglobina Lepore); Aumento del livello di espressione (se posti davanti a “enhancer”); conseguenze meccaniche dovute ai riordinamenti cromosomici instabili (incompatibilità con la divisione mitotica/meiotica; sterilità).

*Instabilità meiotica delle aberrazioni cromosomiche stabili AB C D AC B D pericentriche paracentriche Inversioni: Traslocazioni: A BC DE F A BC ED F Traslocazioni reciproche Traslocazioni Robertsoniane (fusioni centriche) A B C D E M N O P A B C D P M N O E 21 Rb 21-14 + + 14

Aberrazioni cromosomiche stabili: in meiosi = instabilità secondaria Inversioni (in eterozigosi) pericentriche paracentriche A B C E D F A C B D E F

Nella linea germinale la presenza di una inversione (in eterozigosi) si riconosce inequivocabilmente nei meiotici primari (profase meiotica I) per la formazione di un’ANSA di appaiamento, che comprende la porzione corrispondente nei due omologhi (parentale e ricombinante), grazie all’appaiamento nella formazione dei bivalenti. Meiosi I di topo (diplotene). Figure di appaiamenti meiotici con anse da inversione.

*Instabilità meiotica delle aberrazioni cromosomiche stabili 1) inversione pericentrica: Inversione pericentrica AB C D AC B D Omologo con la regione “B-C” invertita Il centromero è all’interno dell’ansa. Solo se si verifica 1 (o un n. dispari) di crossing over all’interno dell’inversione: Nei 2 cromatidi ricombinanti: le regioni esterne all’inversione (A e D) saranno duplicate e delete in modo complementare.

Inversione paracentrica Omologo con la regione “B-D” invertita BC DE F A BC ED F Se si verifica 1 crossing over all’interno dell’inversione: Il centromero è esterno all’ansa! In ciascuno dei 2 cromatidi ricombinanti saranno presenti duplicazioni e delezioni “complementari” delle regioni esterne all’inversione (A ed E): in A è compreso anche il centromero, che quindi in uno dei cromatidi è duplicato (dicentrico) e nell’altro è assente (frammento, =eliminato). In anafase il dicentrico si spezza ed i cromatidi segreganti porteranno un ulteriore delezione.

Appaiamento omologhi: traslocazione reciproca A B C D E M N O P A B C D P M N O E + + N2 T2 Appaiamento omologhi: N1 T1 Solo la segregazione alternata dà prodotti bilanciati e vitali: con questa modalità di segregazione si trovano nella stessa cellula o entrambi i cromosomi traslocati (T1 e T2) o entrambi i parentali (N1 e N2).

Segregazione nel meiocita I e formazione dei gameti: FUSIONI CENTRICHE (traslocazioni Rb). 21 Inizialmente: in eterozigosi nel portatore (genitore) o nelle cellule germinali; Rb 21-14 14 Segregazione nel meiocita I e formazione dei gameti: oppure Gameti bilanciati Gameti sbilanciati Fecondazione e trasmissione alla progenie: eterozigote Rb sbilanciato: 2n-1 sbilanciato eterozigote Rb bilanciato (45, t14q21q) 2n normale 46,-14t(14q21q)

IN MEIOSI (gameti prodotti) + + +

Riassumendo: gli effetti dei riordinamenti cromosomici (in eterozigosi) dal momento della loro comparsa, possono comportare: letalità cellulare (aberrazioni instabili; aberrazioni sbilanciate); Formazione di un clone; Nessun effetto. in cellule della linea SOMATICA: Non trasmissibili alla progenie Possono essere considerate solo aberrazioni stabili, poiché quelle instabili vengono eliminate durante le precedenti divisioni mitotiche (linea goniale). In meiosi tuttavia anche queste sono sottoposte a selezione ed eliminazione, a causa di: instabilità secondaria o per segregazione adiacente, in meiosi I. Se non ci sono effetti di “selezione meiotica” (segregazione anomala) = 50% gameti mutanti in cellule della linea GERMINALE: Trasmissibili alla progenie

Il cromosoma Phladelphia (Ph) è considerato un ‘marcatore’ della leucemia mieloide cronica (CML): risulta dalla traslocazione reciproca t-9:22, in cui le rotture interrompono i due loci ABL e BCR, rispettivamente. Il cromosoma Ph è rilevabile citologicamente (cromosoma ‘extra’ del gruppo G). La giustapposizione dei loci ABL e BCR interferisce con i geni soppressori cancro (oncogeni ), e si traduce in una forma specifica di tumore, leucemia cronica Myologenous (CML). Distrofia muscolare di Duchenne (DMD): in questo caso la patologia è data dalla traslocazione reciproca t 21-X (in eterozigosi). La rottura ha reso inattivo l’allele DMD+. L’altro allele è reso non funzionale dall’inattivazione dell’altro X. Altri tipi di tumori solidi hanno alla base traslocazioni che possono rendere attivi alcuni geni.

Come riconoscere citogeneticamente le inversioni? Nelle cellule somatiche le inversioni si possono distinguere solo utilizzando tecniche di bandeggio di preparati cromosomici (o attraverso tecniche di ibridazione in situ); Solo alcune inversioni pericentriche si possono distinguere più facilmente, per l’alterazione del rapporto della lunghezza tra i bracci, quando i 2 punti di rottura hanno distanze molto diverse dal centromero.

TRASLOCAZIONI Citogeneticamente riconoscibili solo per: Cambiamento lunghezza totale e/ o posizione del centromero; Cambiamento n° e posizione delle bande (bandeggio). Oppure attraverso ibridazione in situ (FISH) Effetti genetici: Sterilità parziale (50% dei gameti sbilanciati) Fenotipo di associazione nuovo: se 2 marcatori di 2 cromosomi non omologhi si trovano vicino ai punti di rottura, nel cromosoma traslocato essi si troveranno in associazione (linkage).

Ad eccezione delle traslocazioni Robertsoniane: Traslocazioni RB in spermatociti II di topo.

EFFETTO DI POSIZIONE I geni contenuti in regioni eterocromatiche sono inattivi. Se un gene attivo viene traslocato in una regione eterocromatica, questo viene inattivato. Esempio: Variegatura dell’occhio (drosofila). Se in un eterozigote w+/w (fenotipo occhi rossi) il gene w+ viene spostato dalla regione eucromatica dell’X ad una regione eterocromatica del 4, può venire inattivato. TUMORI NELL’UOMO. Il linfoma di Burkitt è causato dallo spostamento di un proto-oncogéne vicino ad una regione che stimola la produzione di anticorpi. Questo spostamento rende attivo l’oncogéne ed innesca lo sviluppo del cancro.

Duplicazioni e delezioni

(appaiamento sfalsato + crossing over tra i due loop) IN MEIOSI: CROSSING OVER INEGUALE Genotipo parentale (appaiamento sfalsato + crossing over tra i due loop) Dup Del Genotipi ricombinanti: 1 omologo duplicato (Dup) + 1 omologo deleto (Del).

Emoglobina umana Le duplicazioni hanno un ruolo evolutivo importante perchè fonte di materiale ridondande in cui le mutazioni possono creare nuove funzioni geniche

Sbilanciamento nel dosaggio proteico-enzimatico DELEZIONI Perdita di un frammento interstiziale (2 rotture e risaldatura) - Perdita di un frammento terminale (1 sola rottura) In funzione della dimensione del frammento deleto ci sono effetti diversi: intragenica: inattivazione del gene multigenica (eliminazione di intere bande o +): inattivazione di più geni EFFETTI GENETICI No RETROMUTAZIONI 1) In ETEROZIGOSI: Permette l’espressione di geni recessivi (alleli difettivi o letali) = PSEUDODOMINANZA Sbilanciamento nel dosaggio proteico-enzimatico DEFICIT O LETALITA’ Le delezioni in eterozigosi sono scarsamente tollerate da cellule/tessuti/organismi) La delezione di un gene dominante, in eterozigosi, permette l’espressione dell’altro allele e nel nuovo fenotipo compare la manifestazione dell’allele recessivo. Questo può sembrare l’effetto di una mutazione dominante. 2) In OMOZIGOSI: LETALITA’ per mancanza totale del gene / dei geni contenuti nella regione deleta, su entrambi i cromosomi omologhi. Le delezioni in omozigosi sono sempre letali (come fossero dei caratteri letali recessivi).

DELEZIONI: COME SI IDENTIFICANO 1) CITOGENETICAMENTE (analisi strutturale al microscopio): Se la delezione è sufficientemente grande (una banda) si formano anse di appaiamento in cellule somatiche (es. cromosomi politenici di drosofila) o nei bivalenti (appaiamento tra omologhi in meiosi). Ibridazione in situ: rivela la posizione di regioni attraverso la marcatura specifica con sonde di DNA 2) GENETICAMENTE FR ridotta nelle regioni adiacenti alla delezione si manifesta la pseudodominanza Si manifesta l’effetto letale dei geni recessivi “scoperti” Non c’è retromutazione MAPPATURA PER DELEZIONE Le delezioni possono essere utilizzate per localizzare nuovi alleli mutanti sfruttando l’effetto della PSEUDODOMINANZA. Nuovi alleli mutanti, mostrano il loro effetto recessivo solo se localizzati in corrispondenza della regione deleta, Sindrome Crie du chat: perdita della regione terminale del braccio corto del cromosoma 5 (origine spontanea)

DUPLICAZIONI Possono trovarsi in posizione adiacente: oppure localizzate in altre posizioni (sullo stesso o su altro cromosoma) In meiosi: appaiamento tra omologhi Se in ETEROZIGOSI si distinguono perché formano anse da appaiamento

In OMOZIGOSI: indipendentemente dalla loro localizzazione, in seguito ad appaimento sfalsato producono ulteriori duplicazioni e delezioni (crossing over asimmetrico). Occhio bar (drosofila): duplicazione regione 16A su cromosoma X