Lignina Polimero costituito da unità fenilpropanoide unite da legami C-C e C-O. Viene prodotta in grande quantità nell’industria di lavorazione del legno e come scarto nell’industria cartaria

Biodegradazione della lignina In natura esistono organismi che sono capaci di degradare la lignina. sono funghi del genere Phanerochaete chrysosporium  Il fungo produce durante il metabolismo secondario 2 enzimi capaci di degradare la lignina: lignina perossidasi (LiP) e manganese perossidasi (MnP)  Produce un sistema che genera H2O2 (enzimi come gliossal ossidasi)  Produce molecole organiche come alcol veratrilico e ossalato, coinvolti nella degradazione della lignina

Perossidasi Sono divise in tre grandi famiglie Da pianta Piante Funghi Batteri Animali Altra origine Le perossidasi da pianta sono suddivise in base all’origine, i.e. se estratte da: Procarioti – Classe I Funghi – Classe II Piante – Classe III

Perossidasi da pianta 2 domini  Classe I Classe II Classe III CcP APX LiP MnP CiP Classe III PNP HRP

LiP e MnP Sia LiP che MnP sono emeproteine. Il meccanmismo di entrambe è simile: formano 2 intermedi ossidati, il composto I e il composto II Lip ossida, in presenza di H2O2 una grande varietà di substrati aromatici (fenolici o non fenolici) formando un catione radicale. Questo catione radicale è capace di generare reazioni non enzimatiche di rottura del legame C-C e C-O. MnP e’ una proteina Mn-dipendente. La sua espressione è regolata dalla presenza di Mn nel mezzo di coltura. Ossida il Mn2+ a Mn3+ in presenza di H2O2 e acidi organici chelanti. Mn è un forte ossidante, Ossida una grande varietà di composti fenolici e può agire come ossidante diffisubile sulla lignina

Mechanisms of LiP and MnP Mechanisms of LiP and MnP. LiP and MnP exhibit similar mechanisms to other peroxidases. The initial reaction in both systems involves a two electron cleavage of the peroxide dioxygen bond to produce water and a two-electron oxidized form of the enzyme (compound I). Compound I oxidizes a substrate by one electron to produce a free radical product and the one-electron reduced form of the enzyme (compound II). Transfer of a second electron from substrate to compound II is the final step of the catalytic cycle, reducing the enzyme back to its native state. Substrate A can be a phenolic or nonphenolic compound, but nonphenolics are the preferred substrates (Paszczynski et al., 1986). For MnP, B can be Mn2+, which is then oxidized to Mn3+ (as in reaction step 3) or a phenolic substrate. Step 3 requires Mn2+ (Wariishi et al., 1988), and the Mn2+ must be chelated to an organic acid chelator (Kuan et al., 1993).

Sito catalitico della Mn perossidasi

Il ciclo catalitico delle perossidasi In this mechanism, the enzyme reacts with one equivalent of H2O2 to give compound I, a porphyrin ­cation radical containing FeIV. This is a two­electron oxidation/reduction reaction where H2O2 is reduced to water and the enzyme is oxidised. One oxidising equivalent resides on iron, giving the oxyferryl (FeIV=O) intermediate. Compound I then oxidises an organic substrate to give a substrate radical (·AH). Compound I undergoes a second one­electron oxidation reaction yielding compound II, which contains an oxyferryl centre coordinated to a normal (dianionic) porphyrin ligand. Finally, compound II, is reduced back to the native ferric state with concomitant one­electron substrate oxidation. The overall charge on the resting state and compound I is +1, while compound II is neutral (cf. catalase and chloroperoxidase). Composto II Composto I

Ruolo del veratril alcol Tre ipotesi sono state fatte sul ruolo dell’alcol 3,4-dimetossi benzilico (Veratril alcol) nella degradazione della lignina da parte della LiP Mediatore redox: LiP catalizza l’ossidazione monoelettronica del VA formando Un catione radicale che diffonde dal sito attivo e ossida alcol anisilico o metossimandelico ai rispettivi cationi radicali. Questo modello suggerisce un meccanismo per cui la LiP potrebbe ossidare il substrato ingombrante a distanza dal sito attivo. 2) Protegge dall’inattivazione dovuta a H2O2. In eccesso di H2O2 e in assenza di substrato LiP viene inattivata per formazione di complesso con il diossigeno (composto III). Cationi radicali del veratril alcol possono riconvertire il composto III alla specie nativa dell’enzima. 3) Agisce per completare il ciclo catalitico, in presenza di substrati che non possono riconvertire il composto II all’enzima nativo. Substrati con potenziale redox piu’ basso del composto I, ma piu’ alto del composto II non sono in grado di completare la reazione. VA serve come substrato del composto II completando il ciclo.

Structure of aromatic alcohol substrates and their corresponding aldehydes.

Ruolo del veratril alcol

Ruolo dell’ossalato L’ossalato viene prodotto contemporaneamente alla MnP. MnP necessita Mn2+. La reazione dell’enzima con Mn2+ a Mn3+ è stato visto essere dipendente dalla presenza di acidi organici come ossalato. Ipotesi sul ruolo dell’ossalato. Sulla base di una bassa reattività del Mn 2+ libero con il composto II è stato ipotizzato che formi complessi chelati sia con il Mn 2+ che con il Mn3+ 2) Chela solo il Mn 3+ e lo stabilizza. I complessi stabili di Mn 3+ possono agire come ossidanti diffusibili di substrati lontani dal centro attivo.

Ruolo dell’ossalato Dati recenti hanno indicato che la MnP lega sia Mn2+ che Mn3+. L’ossalato non rimuove Mn2+ dalla MnP, ma lega Mn3+ formando un complesso Che diffonde. Questa ipotesi contrasta con i dati cinetici che indicano bassa velocità di riduzione del composto II, da parte del Mn2+ in assenza di ossalato. Tutti i risultati possono essere riconciliati sulla base del seguente meccanismo L’ossalato non lega Mn2+ . L’ossidazione del Mn2+ da parte del composto II per rendere l’enzima nativo e Mn3+ viene favorita dalla complessazione del Mn3+ con ossalato, guidando la reazione verso la formazione dei prodotti.

Il sito di legame del Mn(II)

LiP – proprietà strutturali Sono glicoproteine globulari, costituite prevalentemente da eliche. MW 40000 – 343-344 AA Oltre al Mn, legano 2 ioni Ca. Presentano diversi siti di glicosilazione. L’eme divide la proteina in 2 domini (distale, sotto il piano dell’eme e prossimale, sopra il piano dell’eme. L’eme, sprofondato all’interno della proteina, presenta un canale di accesso molto stretto che non consente l’ingresso di substrati ingombranti come la lignina, mentre può accogliere molecole piu’ piccole come VA

Helices are depicted as coils and b-strands as arrows, the two calcium ions as spheres. The haem with the proximal and distal histidine, His82 at the entrance of the haem-access channel (left-hand side), four carbohydrate molecules, Trp171 and the disulphide bridges are represented as ball-and-stick models. The distal domain is below and the proximal domain above the haem plane.

VA modelled into the haem-access channel of LiP In this position the substrate is with its 4-methoxy group within van der Waals distance of the 8-methyl substitutent and the propionate group of the pyrrole ring A of the haem. A hydrogen bond of the hydroxy group of VA with His82 at the entrance of the channel is depicted as a white line.

Trp 171, attribuibile alla presenza di un gruppo OH. L’indagine strutturale ha messo in evidenza una significativa densità eletronica sul C del Trp 171, attribuibile alla presenza di un gruppo OH. Tale idrossilazione avviene in presenza di H2O2. Trp 171 sembra coinvolto nel meccanismo catalitico, comportandosi come donatore interno di elettroni e generando un radicale catione Trp. Il residuo 172, contiguo al Trp, è in contatto di Van der Waals conL’eme e puo’ rppresentare una via di passaggio degli elettroni dal Trp 171 al cofattore. Il gruppo OH, con effetto elettron attrattore sull’anello indolico, puo’ stabilizzare il radicale catione e la sua reattività

Struttura della MnP MnII, lega un propionato dell’eme e le catene laterali di 3 AA, Glu35, Glu39, and Asp179, e a 2 molecole di solvente

Rappresentazione stereo del sito attivo Il residuo del sito attivo Arg 42 è mostrato nelle 2 conformazioni, nativa e composto I.