Laboratorio di Chimica Organica AA 2015-2016 docenti: Francesco Peri Barbara La Ferla Cristina Airoldi

Introduzione al laboratorio di chimica organica Norme di sicurezza: occhiali, camice, norme di comportamento L'uso di solventi organici e dell'acetone per anidrificare la vetreria Lo smaltimento differenziato dei solidi e dei solventi La vetreria: inventario ed armadietto Altre informazioni tecniche

Le esperienze 1. Cromatografia analitica: cos'e' e come fare una TLC 2. Cromatografia preparativa: separazione dei pigmenti e clorofille contenuti nelle foglie di spinacio mediante cromatografia su colonna di gel di silice 3. Estrazione e purificazione della caffeina dalle foglie di the 4. Separazione di bifenile ed acido benzoico da una miscela solida 5. Riduzione della etil vanillina con sodio boroidruro

Le tecniche del laboratorio cromatografia: esperienze 1 e 2 estrazione liquido-liquido: esperienze 3 e 4 sintesi organica e reazioni organiche: esperienza 5

Esperienza 1 la cromatografia su strato sottile, THIN LAYER CHROMATOGRAPHY, TLC Thin-layer chromatography (TLC) is a chromatography technique used to separate non-volatile mixtures. Thin-layer chromatography is performed on a sheet of glass, plastic, or aluminium foil, which is coated with a thin layer of adsorbent material, usually silica gel, aluminium oxide (alumina), or cellulose. This layer of adsorbent is known as the stationary phase.

applicare il campione con il capillare ed eluire con solvente in barattolo chiuso After the sample has been applied on the plate, a solvent or solvent mixture (known as the mobile phase) is drawn up the plate via capillary action. Because different analytes ascend the TLC plate at different rates, separation is achieved

La Cromatografia CROMATOGRAFIA: separazione di una miscela in varie frazioni per distribuzione tra due fasi, una FASE STAZIONARIA immobile ed una FASE MOBILE. Il principio della cromatografia è che SOSTANZE DIVERSE HANNO COEFFICIENTI DI RIPARTIZIONE DIVERSI TRA LA FASE MOBILE E STAZIONARIA. La miscela da separare è “trascinata” dalla fase mobile in modo dinamico: la componente che interagisce di più con la fase stazionaria è quella che viene RITARDATA di più.

il principio della cromatografia: ripartizione tra FS e FM RACCOGLIENDO LA FASE MOBILE IN FRAZIONI E’ POSSIBILE OTTENERE GLI ANALITI PURI Analita T0 Fase stazionaria T1 T2 Fase mobile

Classificazione delle tecniche cromatografiche FASE MOBILE NOME FASE MOBILE FASE STAZIONARIA Gas crom. (GC) Gassosa Solida Crom. Liquida Liquida

Classificazione delle tecniche cromatografiche PRINCIPIO CHIMICO-FISICO NOME PRINCIPIO CHIMICO-FISICO C. di adsorbimento polarità C. a scambio ionico Int. elettrostatiche (ioni) C. di esclusione (gel filtrazione) dimensione delle molecole

La cromatografia per adsorbimento FASE STAZIONARIA: silice FASE MOBILE: solvente organico o miscele di solventi La silice è più polare dei solventi organici: la cromatografia si definisce in fase diretta Le molecole più polari interagiscono di più’ con la fase stazionaria (vengono “ritardate” più delle molecole meno polari).

Classificazione delle tecniche cromatografiche per adsorbimento TIPO DI SUPPORTO NOME SUPPORTO C. su colonna Colonna C. su strato sottile (TLC) Strato sottile su supporto di vetro, alluminio, plastica

Ordine di eluizione dei composti chimici (naturali o di sintesi) Idrocarburi saturi Alcheni Idrocarburi aromatici Eteri Aldeidi, chetoni, esteri Alcoli, ammine Ammidi Acidi carbossilici Polarità crescente Rf crescente

Serie eluotropiche Etere di petrolio Benzene Cloruro di metilene Dietil etere Acetato d’etile Acetone Etanolo Acido acetico Polarità crescente

Cromatografia su silice dei coloranti alimentari e dei pigmenti nei colori a pennarello Fase stazionaria: silice (TLC) Fasi mobili: miscele di solventi organici con polarità variabile Esempi: miscele etere petrolio/AcOEt miscele AcOEt/etanolo miscele etere petrolio/diclorometano AcOEt puro EtOH puro diclorometano puro Cromatogramma su silice di un inchiostro nero

IL COLORE: i coloranti ad uso alimentare Brilliant Blue FCF (noto anche come FD&C Blue No.1, Food Blue 2, Acid Blue 9, D&C Blue No. 4, Alzen Food Blue No. 1, Alphazurine, Atracid Blue FG, Erioglaucine, Eriosky blue, Patent Blue AR, Xylene Blue VSG, and C.I. 42090, ) E Number: E133 Colore verde utilizzato per gelati, piselli in scatola, prodotti alimentari vari, dolciumi, bevande Saponi, sciampo ed altri prodotti cosmetici Consumo pro-capite (USA) 16 mg/persona

IL COLORE: i coloranti ad uso alimentare Fast Green FCF (noto anche come Food green 3, FD&C Green No. 3, Green 1724, Solid Green FCF, and C.I. 42053) E number is E143 (proibito in UE) Colore: verde acqua utilizzato per: piselli in scatola, marmellate, salse, pesce, dolci Utilizzato anche come colorante per la determinazione quantitativa di istoni, dopo estrazione del DNA, nell'elettroforesi di proteine (lmax 625 nm)

IL COLORE: i coloranti ad uso alimentare Sunset Yellow FCF (noto anche come Orange Yellow S, and FD&C Yellow 6 ) E Number E110 Colorante giallo utilizzato per marmellate, dolci, bevande, alcuni yogurt alla frutta

Calcolare l'Rf Rf1 = d1/ds Rf2 = d2/ds ds d1 d2

ricorda: le sostanze APOLARI salgono in alto (idrocarburi, olefine, eteri) le sostanze polari stanno più in basso (alcoli, acidi carbossilici ed ammine) I chetoni ed aldeidi stanno a metà tra queste classi di composti a parità di solvente e fase stazionaria l'Rf è associato in modo univoco alla molecola per aumentare l'Rf si può aumentare la polarità della miscela di solventi, per esempio aumentare la % di AcOEt in una miscela etere petrolio/AcOEt per diminuire l'Rf si deve diminuire la % dell'eluente più polare

cromatografia per adsorbimento preparativa su colonna di gel di silice Esperienza 2 cromatografia per adsorbimento preparativa su colonna di gel di silice

IL COLORE: spettri di assorbimento di alcuni pigmenti vegetali

Separazione dei pigmenti presenti negli spinaci Pigmento giallo (440, 470 nm) -CAROTENE Pigmento giallo (477 nm) XANTOFILLA CLOROFILLA A Pigmento blu-verde (430, 662 nm) CLOROFILLA B Pigmento giallo-verde (453, 642 nm)

Separazione dei pigmenti presenti negli spinaci -Carotene precursore della vitamina A. agente con proprietà anti-ossidanti molto usato come colorante alimentare integratore vitaminico agente farmaceutico e cosmetico Xantofille prodotto dell'ossidazione dei caroteni pigmenti accessori della fotosintesi danno la tipica colorazione bianco-giallastra alle foglie cresciute al buio.

Separazione dei pigmenti presenti negli spinaci ESTRAZIONE DALLA FONTE NATURALE pestellare 2,5 g di foglie di spinaci e pestati con 10 mL EtOH 95%. rimuovere l’ EtOH per filtrazione sotto vuoto estrarre i pigmenti con 20 mL di etere di petrolio lasciando in agitazione per 10 minuti. la soluzione viene decantata e lasciata evaporare durante la notte filtrare e conservare l’estratto (liquido) PURIFICAZIONE TLC: eluente EP : AcOEt = 7:3 -Carotene Clorofilla a Clorofilla b Xantofille Feofitine

Separazione dei pigmenti presenti negli spinaci PURIFICAZIONE Colonna cromatografica contenente silice da condizionare con 30 ml di EP:AcOEt 9:1 Dopo aver caricato l’estratto (ridisciolto in 3 mL del primo eluente) si eluisce utilizzando come solventi: EP:AcOEt 9:1 (circa 30 mL) -Carotene (giallo) EP:AcOEt 7:3 (circa 50 mL) Clorofille (Verde) AcOEt (circa 40 mL) Xantofille (giallo) 2 1 3

Esperienze 3 e4: estrazione liquido-liquido Separazione, purificazione ed analisi della caffeina dalle foglie di tè; separazione acido-base del bifenile e dall’acido benzoico Estrazione SOLIDO-LIQUIDO Estrazione LIQUIDO-LIQUIDO Cromatografia su scala analitica Cristallizzazione Punto di fusione

Estrazione liquido-liquido Distribuzione di una sostanza tra due fasi liquide NON MISCIBILI. Si definisce coefficiente di ripartizione K di una sostanza K = Ca/Cb a T costante con Ca = concentrazione all’equilibrio della sostanza nella fase “a”; Cb = concentrazione all’equilibrio della sostanza nella fase “b”. Normalmente in chimica organica una delle due fasi è acqua e l’altra un solvente organico e K è molto elevato. FASE ACQUOSA A B

Estrazione liquido-liquido SCELTA DEL SOLVENTE ADATTO PER L’ESTRAZIONE: FASE ACQUOSA A B il valore di K deve essere il più alto possibile il solvente deve estrarre selettivamente la sostanza desiderata il solvente deve essere facilmente separato dalla sostanza purificata il solvente deve essere immiscibile con l’altro solvente in cui la sostanza voluta è disciolta i due solventi devono avere densità diversa perché si abbia una rapida separazione tra le fasi.

Estrazione liquido-liquido

Estrazione liquido-liquido Meno densi dell’acqua Più densi dell’acqua Etere etilico Cloruro di metilene Esano, Etere di petrolio Cloroformio Acetato d’etile Carbonio tetracloruro Metanolo

Estrazione liquido-liquido Estrazione di composti organici acidi o basici RCOOH + NaOH RCOO- Na+ + H2O RNH2 + HCl RNH3+ Cl-

Cristallizzazione Le sostanze cristalline impure possono essere purificate per cristallizzazione da un opportuno solvente. Esempio: composto “A” (es. caffeina) contaminato da impurezze “B” La maggior parte delle sostanze è più solubile nei solventi caldi piuttosto che in quelli freddi Le impurezze presenti hanno solubilità diversa rispetto a quella dei composti da purificare. 1 Sciogliere il soluto a caldo 2 Cristallizzare il solido 3 Filtrare il solido 4 Essiccare i cristalli

Filtrazione

3. Estrazione della caffeina dalle foglie di tè 1,3,7-trimetilxantina Formula molecolare = C8H10N4O2  Massa molare = 194,19 g/mol1 p.f. = 219 °C Alcaloide naturale contenuto in foglie, frutti e bacche di certe piante (foglie del tè, semi di caffè). Ha azione tonica e stimolante del sistema nervoso centrale, della muscolatura cardiaca e del sistema respiratorio. E’ usato come stimolatore cardiaco e dell’attività cerebrale. Il suo abuso provoca aritmia cardiaca, insonnia, cefalea. OSSERVAZIONI: la caffeina è circa 9 volte più solubile in diclorometano che in acqua. Metodo base per decaffeinare il caffè.

procedura sperimentale ESTRAZIONE DALLA FONTE NATURALE portare ad ebollizione 100 mL di H2O e mettere in infusione tre bustine di te’ per circa 5 minuti. PURIFICAZIONE estrarre con 20 mL CH2Cl2 (2 volte) cristallizare in Acetone a caldo (circa 1 mL) a Etere di Petrolio (fino ad opalescenza) filtrare sottovuoto per recuperare il solido e pesare CARATTERIZZAZIONE purezza ed Rf da TLC punto di fusione

Estrazione liquido-liquido RCOOH + composto neutro Composto neutro RCOOH Fase organica contenente il composto neutro Fase acquosa contenente RCOO- Na+ Estrazione con soluzione basica Acidificazione Filtrazione Anidrificazione Evaporazione del solvente

4. Separazione Bifenile e Acido benzoico ACETATO DI ETILE FASE ACQUOSA NaOH BIFENILE ACIDO BENZOICO + NaCl HCl

procedura sperimentale Disciogliere 500 mg di miscela in 20 mL di AcOEt Estrarre con 10 mL di NaOH al 5% per 2 volte Riunire la fase organica ed estrarla nuovamente con 5 mL di NaOH al 5% FASE ACQUOSA acidificare con HCl 5% fino a pH acido filtrare il precipitato su buchner e pesare FASE ORGANICA anidrificare con Na2SO4 evaporare il solvente al Rotavapor e pesare CARATTERIZZAZIONE: purezza da Rf e da TLC punto di fusione

5. Riduzione dell’etil vanillina con sodio boroidruro Come effettuare una reazione chimica Verifica dell’andamento (TLC) Isolamento del prodotto dalla miscela di reazione Calcolo della resa di reazione

Il meccanismo di reazione

Le fasi di una reazione Aggiunta dei reagenti Reazione (monitoraggio TLC) Spegnimento (con acqua) Recupero del prodotto (cromatografia o cristallizazzione) Caratterizzazioen del prodotto (PF, spettrometrie) Calcolo della resa

Resa % = x 100 Moli di prodotto ottenuto Moli di reattivo di partenza

procedura sperimentale Si pesano 500 mg di etil vanillina Si sciolgono in un pallone con 3 mL di EtOH e si porta a 0°C con ghiaccio. Sotto agitazione si aggiunge NaBH4 (100 mg) Si controlla la reazione con TLC EP/AcOEt = 6/4 Terminata la reazione si aggiungono 10 mL di HCl 5% e si lascia agitare qualche minuto Si estrae con AcOEt 2 x 10 ml Si anidrifica la fase organica, si filtra in un pallone asciutto, si evapora il solvente (cambia odore) Pesare e calcolare la resa