Il DNA mobile: gli elementi trasponibili ed il loro utilizzo in genomica

Mutagenesi inserzionale mediata da elementi trasponibili; il vantaggio della mutagenesi inserzionale mediata da elementi trasponibili permette una facile mappatura dell’inserzione e un rapido clonaggio del gene alterato

La mutagenesi inserzionale con elementi trasponibili modificati (P in Drosophila) è una strategia utilizzata prima in genetica diretta e dopo in genetica inversa Genetica diretta: Induzione di mutazioni inserzionali in geni essenziali (vitalità, fertilità) precedentemente identificati da analisi mutazionale e con fenotipo mutante noto Scopo: di isolare la sequenza di DNA e delucidare la funzione del gene e del suo prodotto Genetica inversa: Induzione di mutazioni inserzionali in geni putativi identificati dall’analisi bio- informatica della sequenza del genoma di cui non sono disponibili alleli mutanti. Scopo: verificare se il gene putativo è essenziale e identificare la funzione del prodotto proteico Mutagenesi inserzionale

Gli elementi genetici trasponibili (trasposoni, elementi mobili, elementi nomadici) Definizione: Sequenze di DNA in grado di variare la propria localizazione all’interno del genoma (sia all’interno di uno stesso cromosoma che tra cromosomi diversi). Presenza: gli elementi trasponibili sono componenti ubiquitari e abbondanti dei genomi eucariotici, 15% in Drosophila, 45% nella specie umana, 50% nel Mais e addirittura 90% in altre piante.

La scoperta degli elementi trasponibili

Elementi di controllo nel mais 1950 Barbara McClintock Studiando fenomeni di instabilità genetica nel granturco scopre un fattore genetico Ds (Dissociatore) e Ac (Attivatore) “Bisogna sempre credere alle nostre osservazioni, per quanto bizzarre possano essere, forse stanno cercando di dirci qualcosa” (Barbara McClintock)

Il lavoro di Barbara McClintock

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Classificazione degli elementi trasponibili

Meccanismo di trasposizione delle due classi

La % dei vari elementi trasponibili nella specie umana

La scoperta di sequenze mobili di DNA, e gli effetti genetici da essi prodotti rappresentano una significativa eccezione al mendelismo e ai principi della Genetica classica che vede i geni come entità a localizzazione fissa sui cromosomi. Gli elementi trasponibili violano le leggi della Genetica

I movimenti degli elementi trasponibili generano mutazioni Gli elementi trasponibili possono causare: 1)Mutazioni da inserzione all’interno di geni strutturali o in porzioni regolative 2)Mutazioni cromosomiche (delezioni, duplicazioni, inversioni, traslocazioni,) 3)Aumento ricombinazione Interazioni con il genoma ospite: controllo della trasposizione Significato: 1) Sono parassiti molecolari (DNA egoista) 2) Sono fonte di variabilità genetica e quindi collaborano all’evoluzione del genoma 3) Possono acquisire funzioni essenziali per la cellula e per la sopravvivenza dell’ospite

Effetti genetici: le mutazioni indotte dai trasposoni Inserzioni negli esoni: copia e P nel gene white; Ds in waxy mutazioni nulle Inserzioni nelle regioni regolative: P, gypsy, Tam3 Inserzioni negli introni: Mu in knotted, I in white e rolled Inserzioni nell’eterocromatina Mutazioni cromosomiche: inversioni, delezioni, duplicazioni } mutazioni ipomorfe, ipermorfe, neomorfe

Effetti delle inserzioni sull’espressione del gene Esone interrotto Esone aberrante Deregolazione

Effetti sulla regolazione

L’esempio di Gypsy

Het-A e TART: gli elementi richiesti per la formazione dei telomeri in Drosophila sono uno degli esempi più evidenti di trasposoni che possono acquisizione funzioni essenziali nel corso dell’evoluzione Elementi trasponibili “addomesticati”: il caso dei telomeri di Drosophila

Localizzazione di Het-A e TART nel telomero di 3L

Metodi diagnostici CLASSICI per rivelare eventi di trasposizione

La disgenesi dell’ibrido P-M: quando i trasposoni si attivano (Margaret Kidwell anni ‘70) Incapacità di ceppi di Drosophila di incrociarsi in modo produttivo: gli ibridi non sono fertili Elevata sterilità Elevata frequenza mutazioni Segregazione meiotica alterata Elevata sterilità Elevata frequenza mutazioni Segregazione meiotica alterata

La scoperta degli elementi P (Bingham, Kidwell e Rubin, 1981) disgenesi P-M white Isolamento di una sequenza di 2,9 Kb presente in diversi alleli Analisi molecolare di alleli white indotti in disgenesi Elemento P fino a 50 copie nei ceppi P, assente nei ceppi M + P M white

La disgenesi dell’ibrido P-M: il controllo genetico della trasposizione in Drosophila

La disgenesi P-M: basi molecolari

L’elemento P P è un elemento trasponibile di classe 2 e codifica una trasposasi responsabile della sua mobilizzazione. In presenza della trasposasi, qualsiasi frammento di DNA posto tra le regioni terminali invertite (IR) puo’ essere trasposto L’elemento P si integra preferibilmente nelle estremità 5’ del gene ospite e nelle vicinanze o all’interno di altri elementi P. E’ stata messa in evidenza una leggera preferenza per sequenze target GGCCAGAC

Le due classi di elementi trasponibili eucariotici

Meccanismo di trasposizione di P Gli elementi P si muovono mediante un meccanismo di TAGLIA e INCOLLA

Splicing alternativo e trasposizione di P Gli elementi P sono presenti nei cromosomi di cellule somatiche germinali ma la TRASPOSASI è attiva solo in quelle germinali STOP

Trasferimento orizzontale di P

Utilizzo pratico degli elementi P per transgenesi e mutagenesi inserzionale

Spradling and Rubin utilizzano gli elementi P come vettori per trasformare le cellule della linea germinale con DNA esogeno ed inserirlo stabilmente nei cromosomi. Elementi P “ingegnerizzati” per transgenesi in Drosophila (Spradling and Rubin 1982)

Elementi P “ingegnerizzati” per transgenesi in Drosophila PLASMIDE DONATORE: 1) Transgene di interesse (tra seq ripetute invertite 5’P-3’P) 2) gene reporter (LacZ) 3) gene marcatore fenotipico (w+ occhi rossi) PLASMIDE con gene della TRASPOSASI: 1) Codifica per trasposasi 2) Sequenza IR 5‘ difettiva TRASPOSiZIONE INATTIVA Embrione wt -/- Iniezione dei 2 vettori in embrione precoce Il vettore P con il DNA esogeno si integra in alcune della linea germinale

Elementi P “ingegnerizzati” per transgenesi in Drosophila

La mutagenesi inserzionale con elementi trasponibili modificati (P in Drosophila) è una strategia utilizzata prima in genetica diretta e successivamente in genetica inversa Genetica diretta: Induzione di mutazioni inserzionali in geni essenziali (vitalità, fertilità) precedentemente identificati da analisi mutazionale e con fenotipo mutante noto. Mutagenesi inserzionale generalizzata e selezione di alleli. Scopo: di isolare la sequenza di DNA e delucidare la funzione del gene e del suo prodotto Genetica inversa: Induzione di mutazioni inserzionali in geni putativi identificati dall’analisi bio-informatica della sequenza del genoma di cui non sono disponibili alleli mutanti. Mutagenesi sito-specifica; Gene disruption Scopo: analisi funzionale di geni e loro prodotti Mutagenesi inserzionale

Elementi P “ingegnerizzati”

Elementi enhancer trap I costrutti enhancer trap: permettono in particolare di “pescare” sequenze regolative di DNA Il costrutto di questo tipo è formato da: Una coppia di IR che rappresentano le estremità di un elemento trasponibile P. Un promotore minimo Un gene reporter (lac Z oppure GFP) posto all'estremità del costrutto per renderlo il più sensibile possibile quando si trova nelle vicinanze di un enhancer (non viene mai posizionato al centro). Il promotore minimo, infatti, non consente un' espressione rilevabile del reporter. Un gene marcatore fenotipico (rosy+ o white+) Sequenze necessarie per la replicazione e selezione del DNA plasmidico in E.coli

Espressione del gene reporter lacZ in ghiandole salivari Quando il elemento P si inserisce vicino ad un sito enhancer, il gene reporter lac Z viene espresso e acquisisce il pattern di espressione stadio e tessuto specifico determinato dall’enhancer

Espressione del gene reporter lacZ (  -gal) “guidata” da specifici enhancer durante l’embriogenesi di Drosophila mesoderma viscerale ectoderma lateraledisco imaginale della zampa ibridazione in situ RNA-RNA

I costrutti P(EP): modificano il profilo di espressione del gene in cui si inseriscono utilizzando sequenze regolative UAS di lievito Il costrutto è formato da: Sequenze UAS (upstream activator sequence) Gene marcatore fenotipico (rosy o white) Sequenze necessarie per la propagazione del DNA plasmidico in E.coli Quando il costrutto si inserisce al 5’ di un gene nell’orientamento corretto, l’espressione del gene può essere indotta esprimendo contemporaneamente un driver GAL4. L’espressione anomala del gene può produrre un fenotipo anomalo Elementi P (EP) per missespression

Elementi per Gene Disruption Project Elemento P(GT1) Il GAL4 è privo di un promotore ma possiede un sito accettore di splicing (GU), quindi si esprime solo quando si inserisce a valle di un promotore o di una sequenza “splice donor” (AG). Il mini-white ha un promotore proprio e un sito donatore di splicing al 3’ (AG), ma è privo di una sequenza-segnale di poliadenilazione (il mini-white viene espresso quando si viene a trovare a monte di una sequenza di poliadenilazione). lac-z

Elemento P(SUPor-P) Il mini-white è delimitato da sequenze “insulator” derivate dal retrotrasposone gipsy che bloccano l’interazione enhancer-promotore. Se il costrutto si inserisce nelle regioni regolative al 5’ di un gene causa una mutazione di tipo regolativo con una frequenza maggiore rispetto ad altri costrutti che non bloccano l’interazione fra sequenze regolatrici Elementi per Gene Disruption Project

Dove mappa la mutazione ? (sul cromosoma 2 o sul 3?)

Incroci per mappare la mutazione inserzionale

Mappatura per ibridazione in situ sui cromosomi politenici usando come probe il DNA di P

Localizzazione delle inserzioni di P mediante FISH

Verificare che fenotipo mutato sia effettivamente causato dall’inserzione dell’elemento P.

escissione Escissione dell’inserzione dell’elemento P e reversione del fenotipo mutante Allele inserzionale di partenza (mini-white dà occhi rossi ) Perdita del’inserzione (occhi bianchi); confermata per FISH Test di complementazione con allele inserzionale originale per verificare effettiva reversione

Clonaggio del gene Se la mutazione è causata dall’inserzione di un elemento P il gene si può clonare mediante: Plasmid rescue PCR inversa

Digestione con X Ligazione Trasformazione in cellule E.coli amp R XX OriC X amp R OriC XX amp R DNA genomico trasposone Plasmid rescue

Digestione con X Ligazione X X X DNA genomico trasposone A B XX X A B PCR inversa PCR inversa PCR inversa Genomic DNA is digested into fragments of a few kilobases by a usually low-moderate frequency (6-8 base) cutting restriction enzyme Under low DNA concentrations, self- ligation is induced to give a circular DNA product. PCR is carried out as usual, with primers complementary to sections of the known internal sequence.

P-element Gene Disruption Project

L’escissione imprecisa di P c) Riparazione “Homology-directed” da cromatide fratello d) Riparazione “Homology-directed” da cromosoma omologo e) Riparazione “Non-homologous end-joining” lascia un “impronta “ che contiene sequenze di una o entrambe le IR contains inverted repeats f) Piccole delezioni g) Gap repair utilizzando uno stampo “ectopico” per introdurre sequenze specifiche

Mutagenesi inserzionale random mediata da piggyBac La mutagenesi inserzionale mediata dall’elemento P, pur avendo permesso di mutagenizzare su larga scala più del 40% dei geni di Drosophila ha, tuttavia, una forte limitazione legata al fatto che l’elemento P non si integra in maniera random nel genoma, ma ha dei siti preferenziali di inserzione (hotspots) Per questo motivo è stato sviluppato e messo a punto da Hacker e coll. un nuovo sistema di mutagenesi inserzionale random basato sull’utilizzo dell’elemento piggyBac TTAA

Trasposone a DNA identificato nel lepidottero Trichoplusia ni. L’efficienza di mutagenesi è paragonabile a quella indotta da P L’elemento piggyBac è: stabile nel genoma di Drosophila anche in presenza di elementi P meno suscettibile agli hotspots si integra preferenzialmente in sequenze non target di P produce escissione precisa Mutagenesi inserzionale random mediata da piggyBac

Specie trasformate con piggyBac

Il sistema è basato sull’utilizzo degli elementi trasponibili piggyBac (l’elemento “mutator”) e Hermes (l’elemento jump-starter) opportunamente ingegnerizzati per la trasformazione della linea germinale. Il costrutto piggyBac mutator è formato da: ITR (inverted terminal repeat) di piggyBac Un gene marker (EYFP) sotto il controllo del promotore di Pax6 Un gene reporter (GAL4) Il costrutto Hermes jump-starter è formato da: ITR (inverted terminal repeat) di Hermes Un gene marker (ECFP) sotto il controllo del promotore di Pax6 Il gene che codifica per la trasposasi di piggyBac sotto il controllo del promotore di  tubulina

La specificità di inserzione di piggyBac è diversa da quella di P Table 1. Statistical overview over piggyBac insertions on the third chromosome Categoryn% Single male crosses2,5 Independent insertions recovered1,74170 Insertions on third chromosome79846 Insertions sequenced604 Repetitive46 Unique558 Intergenic insertions254 Insertions in transcripts304 Previously hit by P elements13243 No P element hit reported17257 Lethal insertions131 (72)16 (9) Excised39 Reverted2256 Il 57% delle inserzioni di piggyBac si trova in geni non target di P

Gli elementi P tendono a trasporsi prefenzialmente in siti genomici vicini Local jumping Elemento P gene gene 3 kb Per indurre alleli inserzionali di un gene di cui è nota la sequenza, ma non la funzione è consigliabile una mutagenesi mirata, con un singolo elemento P che mappa in siti adiacenti

Inattivazione dell’espressione genica mediante RNAi

Gli elementi trasponibili nei mammiferi

Meccanismo di trasposizione di L1H

Le malattie da retrotrasposoni

Inserzione di L1 nell’esone 14 del gene per il fattore VIII

Retrotrasposizione e malattie umane Circa 100 casi noti di varie malattie umane ereditarie causate da inserzioni de novo di L1, Alu and SVA: emophilia, fibrosi cistica, Apert syndrome, neurofibromatosi, Distrofia muscolare Duchenne, beta-thalassemia, ipercholesterolemia, cancro del seno e del colon. E’ stato stimato che ~0.3% di tutte le mutazioni presenti nella specie umana è attribuibile a inserzioni de novo L1, Alu e SVA.

Trasferimento orizzontale di L1H in N. gonorrhoeae Una sequenza di 685 bp con un’identità nucleotidica del 98–100%

Retrotrasposizione di L1 in sistemi transgenici di mammifero (Kazazian& co)

I transgeni utilizzati sono rappresentati da un elemento L1 (umano o di topo) che nella regione 3’ UTR contiene una “cassetta di retrotrasposizione” seguita da un poly(A) di SV40 Modelli transgenici di topo e ratto con L1 umani o di topo guidati da promotori endogeni Retrotrasposizione di L1 in sistemi transgenici di mammifero (Kazazian& co)

La progenie di animali transgenici per L1 umano mostrano una elevata attività di retrotrasposizione. Nei topi, gli eventi di retrotrasposizione di L1 sono stati osservati in 133 su 208 individui (64%) della progenie che ha ereditato il transgene e nel 9% di quella che ne era priva. I ratti transgenici hanno mostrato un’attività di retrotrasposizione più elevata rispetto ai topi. Gli eventi di retrotrasposizione di L1 umano sono stati identificati in tutti i 197 ratti che hanno ereditato il transgene e nel 6% di quelli che ne erano privi. In totale, sono stati identificati 35 animali (topi e ratti) che erano transgene-negative, retrotransposition event-positive. Eventi di retrotrasposizione nelle F1 di vari incroci

19 animali transgenici analizzati presentano eventi de novo di retrotrasposizione di L1 Retrotrasposizione in sistemi transgenici di mammifero

Retrotrasposizione di L1 e mosaicismo 1) I topi 11* e 17* non hanno transgene (L1tg), ma mostrano la banda di retrotrasposizione (L1Rtn), sono detti transgene-negative, retrotransposition event-positive 2) Nessuno dei loro figli mostra retrotrasposizione 3) Se ne deduce che 11 e 17 sono un mosaico. Ovvero la retrotrasposizione è avvenuta nelle cellule somatiche d i11 e 17, ma non in quelle della linea germinale.

Trascritti di L1 in vari tessuti e stadi di sviluppo I trascritti sono abbondanti in cellule spermatogeniche e in vari stadi embrionali, mentre non si rivelano in tessuti/organi differenziati, con l’eccezione di polmone e rene nel ratto dove è presente una debole amplificazione.

Eventi di retrotranspositione di L1 in vari tessuti e stadi di sviluppo La retrotransposizione di L1 si osserva raramente nelle cellule spermatogeniche, ma è frequente negli embrioni pre- impianto (blastocisti e morula)

Quantità abbondanti di L1 RNA si trovano principalmente nella frazione di cellule spermatogeniche, dove non si osserva retrotrasposizione. Malgrado l’abbondante quantità di L1RNA nelle cellule spermatogeniche, la quota maggiore di retrotrasposizione avviene dopo la fecondazione (stadi di morula e blastocisti) e potrebbe continuare nel corso dello sviluppo La frequenza stimata di retrotrasposizione di L1 è circa 10 volte maggiore in cellule somatiche di animali che hanno il transgene rispetto a quelli che ne sono privi. La maggior parte degli eventi di trasposizione somatici sono dovuti a L1 trascritto dopo al fecondazione, dando luogo a mosaicismo. I risultati suggeriscono che le cellule germinali hanno un meccanismo di difesa post- trascrizionale che previene l’integrazione di L1 nel genoma. Cellule germinali embrionali hanno abbondanti quantità di RNA di L1 in conseguenza della demetilazione nei testicoli fetali (Kuramochi-Miyagawa et al. 2008), mentre gli L1 nei tessuti somatici differenziati sono silenziati. Possibile ruolo della retrotrasposizione somatica di L1 nello sviluppo precoce con effetti sull’apprendimento e sul comportamento CONCLUSIONI

Trascrizione e retrotrasposizione di L1 in cellule germinali e sviluppo precoce

Retrotrasposizione di L1 nel cervello umano

Retrotrasposon capture (RC) high-throughput assays Campioni di DNA di ippocampo e nucleo caudato di 3 donatori

Retrotrasposizione di L1 nel cervello umano L’ippocampo sembra particolarmente predisposto alla mobilizzazione somatica di L1; questo è particolarmente interessante visto che la zona subgranulare dell’ippocampo è la principale fonte che contribuisce alla neurogenesi adulta. Mosaicismo somatico La mobilizzazione somatica di L1 è correlata alla plasticità neurale? Ovvero, alla c apacità dei neuroni di cambiare le connessioni dei dentriti e neuriti e creare nuove sinapsi. 24,540 inserzioni tra cui L1 (32.2%) e Alu (60.9%). 8.4% di Alu e 1.9% di L1 sono identiche a quelle già annotate in vari cataloghi/database di popolazioni umane e quindi si deduce che derivino da eventi germinali presistenti. La rimanente quota di inserzioni è di natura somatica Geni coinvolti nella neurogenesi e funzioni neurali sono target preferenziali.