CROMATOGRAFIA DI INTERAZIONE IDROFOBICA La complessità delle proteine fa si che spesso nella loro struttura vi siano porzioni idrofiliche con altre più idrofobiche: queste ultime sono in genere almeno parzialmente protette dalla disposizione tridimensionale della molecola, presente in ambiente acquoso Questo tipo di cromatografia sfrutta la presenza di parti idrofobiche nella struttura terziaria delle proteine, suscettibili di interazioni con altri gruppi idrofobici disposti su una matrice utilizzata come fase stazionaria cromatografica Per avere successo, l’interazione idrofobica necessita di concentrazioni saline medio-alte nella fase mobile

Cromatografia per interazione idrofobica (HIC) Separazione delle proteine sulla base della loro idrofobicita’ di superficie I sali ad alta concentrazione riescono ad esporre le regioni idrofobiche, sottraendo le molecole d’ acqua ordinate  le proteine tendono cosi’ ad interagire fra loro (“salting out”). Nella HIC queste regioni cosi’ esposte tendono ad interagire con una fase stazionaria costituita da gruppi idrofobici E’ una cromatografia che è possibile applicare ad esempio dopo il frazionamento con ammonio solfato L’ eluizione puo’ essere effettuata diminuendo la forza ionica oppure per ‘spiazzamento’ con detergenti non ionici come ad es. Tween 20, Triton X-100 Fase stazionaria: matrice rivestita di gruppi idrofobici Fase mobile: solventi polari Eluente : soluzioni con detergenti non ionici, variazioni di pH, riduzione della polarità della fase mobile

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CROMATOGRAFIA LIQUIDA A FASE INVERSA fase stazionaria e’ costituita da catene idrocarburiche apolari (butile, ottile, ottadecile) che formano un film liquido legato al supporto di silice fase mobile è un solvente polare (puo’ essere un tampone acquoso, metanolo, acetonitrile o miscele) La fase stazionaria è essenzialmente inerte ed instaura solo interazioni apolari (idrofobiche) con gli analiti. La separazione cromatografica avviene principalmente sulla base delle caratteristiche della fase mobile

numero più alto di piatti teorici In HPLC (High Pressure Liquid Chromatography) si utilizzano resine con un diametro inferiore rispetto a quelle usate nella cromatografia classica numero più alto di piatti teorici aumenta anche la resistenza al flusso dell'eluente (aumento di pressione) colonna cromatografica rivestita in acciaio

Gli analiti polari eluiscono per primi e quelli non polari per ultimi

SCELTA DELLA FASE MOBILE Non tutti i solventi possono essere utilizzati in HPLC Devono possedere determinate caratteristiche: devono essere miscelabili in diverse proporzioni non devono interagire chimicamente con gli analiti o gli altri solventi devono avere una bassa viscosità La fase mobile più comune in HPLC a fase inversa (RP-HPLC) è costituita da acqua miscelata con metanolo o acetonitrile

Resa= Purezza = Attività specifica mg o U di proteina di interesse nella frazione mg o U di prot. di interesse all’inizio della purificazione Resa= mg di proteina di interesse nella frazione mg di proteine totali presenti nella frazione Purezza = U di proteina di interesse nella frazione mg di proteine totali presenti nella frazione Attività specifica =

La messa a punto di un procedimento sperimentale di purificazione di una proteina richiede la possibilità di: I. un sistema per identificare e quantizzare la proteina di interesse fra tutte le altre proteine del campione [Gli ENZIMI possono essere identificati dalla reazione che essi catalizzano (SAGGIO ENZIMATICO)] II. un sistema per misurare la quantità di proteine totali nel campione III. un sistema per valutare la presenza di proteine contaminati presenti nel campione di interesse

Saggio enzimatico E’ necessario disporre di un opportuno saggio che consenta di seguire la proteina durante i vari passaggi del procedimento di purificazione rapido (eseguibile su molti campioni) quantitativo “economico” (eseguibile con una piccola quantità di proteina) specifico

SAGGI DI ATTIVITA’ ENZIMATICA Gli enzimi possono essere usati come strumenti analitici per identificare o quantificare sostanze chimiche specifiche in soluzione E’ possibile determinare la presenza e la quantità di un determinato enzima in un fluido biologico misurandone l’attività con substrati specifici CONDIZIONI SPERIMENTALI DEL SAGGIO Controllo del pH con una soluzione tampone Controllo della temperatura Assenza di inibitori (agenti chelanti, metalli) In un saggio di attività enzimatica si misura il prodotto della reazione, più di rado il consumo di substrato

catalizzano l’idrolisi di monoesteri del fosfato p-nitrofenil-fosfato SAGGI DIRETTI E + S  E + P (prodotto colorato – cromoforo o fluorescente – fluoroforo) FOSFATASI R-O-PO32- + H2O R-O-H + HO-PO32- Gruppo di enzimi che catalizzano l’idrolisi di monoesteri del fosfato FOSFATASI -PO32- + H2O -H + HO-PO32- p-nitrofenil-fosfato INCOLORE p-nitrofenolo GIALLO

SAGGI DIRETTI + NADH +(ossidato) Piruvato Lattato Deidrogenasi (LDH) (ridotto) + NAD+ Lattato

Le reazioni che richiedono nucleotidi purinici sono molto usate nei metodi enzimatici di analisi Tali coenzimi (NAD, NADH, NADP, NADPH) sono ideali perché sono usati stechiometricamente in un gran numero di reazioni di ossido-riduzione NAD ossidato (non assorbe a 340 nm) NAD ridotto (assorbe a 340 nm) Composto ridotto + NAD+ Composto ossidato + NADH misurazione dell’assorbimento a 340 nm saggio enzimatico non specifico: evidenzia tutti gli enzimi che usano il NAD+

ACCOPPIAMENTO CON REAZIONE IRREVERSIBILE SAGGI ACCOPPIATI E1 + S  E1 + P (prodotto non colorato o fluorescente) E2 + P  E2 + Q (secondo prodotto, Q, colorato) L-treonina aldolasi Esempio: + L-treonina glicina acetaldeide alcol deidrogenasi + NADH + NAD+ acetaldeide alcol etilico ACCOPPIAMENTO CON REAZIONE IRREVERSIBILE E1 E2 A B  C

Metodi radioisotopici Si basano sull’utilizzo di forme radiomarcate di un substrato Sono metodi molto sensibili ma limitati alle applicazioni in cui è possibile separare facilmente i substrati dai prodotti Esempio: misura dell’attività di un’amminotrasferasi + 1a FASE Miscela di reazione lavaggio eluizione Conteggio radiattività 2a FASE (separazione cromatografica e conteggio della radioattività) colonna cromatografica a scambio anionico amminoacidi chetoacidi

METODI IMMUNOCHIMICI L’utilizzo di anticorpi, prodotti contro un particolare enzima, può fornire la base per un dosaggio enzimatico, basato sul metodo ELISA, in grado di distinguere isoenzimi o enzimi diversi che catalizzano reazioni identiche Dosaggio immunometrico mediante anticorpi marcati con enzimi Enzyme-Linked Immunosorbant Assay (ELISA)

SAGGIO ELISA PER LA DETERMINAZIONE DEI LIVELLI DI DHT pg DHT standard Δ/coeff ang/µl sieri