Clonaggio funzionale Clonaggio posizionale Conoscenza proteina Malattia genetica Determinazione sequenza aminoac.Mappatura genetica con marcatori polimorfici Deduzione sequenza nucleotidicaIdentificazione cloni genomici che coprono il sito mappato Sintesi sonda oligonucleotidicaRicerca del gene (varie tecniche) Isolamento clone di cDNADeduzione della struttura aminoac. Isolamento clone genomicoRicerca mutazioni nucleotidiche nelle famiglie affette Caratterizzazione clone genomico Ricerca di mutazioni nucleotidiche Ricerca funzione proteica

Clonaggio funzionale L’identificazione del gene e della sua posizione nel genoma avviene a partire dalla conoscenza della proteina Se la proteina è nota si frammenta in peptidi e si determina la struttura amminoacidica Dalla sequenza amminoacidica si deduce la possibile sequenza codificante, considerando la degenerazione del codice

Esempio di clonaggio funzionale del gene per il fattore VIII della coagulazione Sonde degenerate corrispondenti a una porzione di sequenza amminoacidica del fattore VIII. Ibridazione con cloni di una libreria di cDNA ; il clone di cDNA isolato si usa come sonda per individuare un clone in una libreria di DNA genomico

MARCATORI GENETICI Un marcatore genetico è paragonabile ad un cartellino colorato che serve a “marcare” i cromosomi degli individui in un pedigree. Un marcatore genetico per essere tale deve essere polimorfico ed i suoi diversi alleli possono essere utilizzati per seguire la segregazione di alleli per un altro gene quando si effettuano incroci.

MARCATORI GENETICI Caratteristiche: -Trasmissione mendeliana - Neutralità - Elevato livello di polimorfismo - Tipizzazione facile ed economica - Posizione nota nel genoma

TIPI DI MARCATORI POLIMORFICI - Polimorfismi immunologici (es: gruppi sanguigni, rilevabili con tecniche sierologiche) - Polimorfismi genetici a livello proteico (rilevabili attraverso l’elettroforesi ed altre tecniche di caratterizzazione degli isozimi) - Polimorfismi genetici a livello del DNA

VARIABILITA’ GENETICA SEMPLICE POLIMORFISMO: presenza di 2 o più fenotipi alternativi (morfi) a trasmissione mendeliana MORFI: generalmente determinati da alleli diversi ereditati in modo mendeliano POLIMORFISMO GENETICO Carattere monogenico presente in una popolazione con una frequenza  1% ETEROZIGOSITA’ (H) f(A) = p f(B) = q H = 2pq H aumenta in relazione al numero di alleli del locus

TIPI DI MARCATORI GENETICI NELL’UOMO Tipo di marcatoren° lociCaratteristiche Gruppi sanguigni  20sangue fresco, dominanza Varianti proteiche  30siero fresco, saggi specialistici, polimorfismo limitato RFLP del DNA> alleli, eterozigosità massima 0, VNTR del DNA>10 4 Molti alleli, altamente informativi (minisatelliti) VNTR del DNA>10 5 Molti alleli, altamente informativi (microsatelliti) SNP del DNA>10 6 Meno informativi dei microsatelliti 1998-

LIVELLO DI POLIMORFISMO - Eterozigosità - Contenuto d’informazione del polimorfismo (Polymorphism Information Content = PIC) TASSO DI MUTAZIONE Singola Sostituzione Nucleotidica (SNS):  Variable Number of Tandem Repeat (VNTR): minisatelliti  microsatelliti  Il genoma è un serbatoio potenziale di polimorfismi così vasto da consentire di individuare i marcatori più adatti per affrontare un ampio spettro di problematiche della genetica delle popolazioni umane.

Analisi della segregazione degli alleli per il locus A e degli alleli del locus B Dalle meiosi di II-1 è possibile stabilire: 5 combinazioni parentali e 2 ricombinanti 12 MAPPAGGIO GENETICO DEI CARATTERI MENDELIANI Dopo quante meiosi si può stabilire se i loci A e B sono associati o indipendenti?

LA MAPPATURA GENETICA PRIMA DEI MARCATORI MOLECOLARI DEL DNA Gruppi di associazione tra loci (marcatori proteici) noti e loci responsabili di malattie: ABO - adenilatochinasi ABO - sindrome unghia- rotula Duffy - cataratta congenita Rh - ellissocitosi Collinesterasi - transferrina Lutheran - secretore G6PD - emofilia G6PD - daltonismo A 3 Y A 1 /A 2 c A 2 Y Locus gene G6PD: A 2 = allele normale; A 1 = allele enzimopenia G6PD D/d d d D A 1 Y D Locus Daltonismo: D = allele normale; d = allele daltonismo c daltonico * * enzimopenico

A 1 A 2 A 1 A 2 A) NON INFORMATIVA Gli alleli del marcatore in omozigosi nel padre non possono essere distinti B) NON INFORMATIVA A 1 A 2 La figlia può aver ereditato A 1 dal padre e A 2 dalla madre o viceversa MEIOSI INFORMATIVE E NON INFORMATIVE

C) INFORMATIVA A 1 A 2 A 1 La figlia ha ereditato A 1 dal padre (fratria A 1 A 1 alternativa a A 1 A 2 della famiglia B) D) INFORMATIVA A 1 A 2 A 3 A 4 A 1 A 4 La figlia ha ereditato A 1 dal padre

UNA MEIOSI E’ INFORMATIVA, OVVERO UTILE PER GLI STUDI DI ASSOCIAZIONE (LINKAGE), QUANDO SI PUO’ IDENTIFICARE LA FASE DEI 2 LOCI E QUINDI STABILIRE SE IL GAMETE E’ O MENO RICOMBINANTE PERCHE’ LA MEIOSI SIA INFORMATIVA IL GENITORE DEVE ESSERE DOPPIO ETEROZIGOTE PER I DUE LOCI Es: genotipo locus malattia: Allele normale (+)/ Allele mutato (-) genotipo locus marcatore: A 1 /A 2 +/- A 1 /A 2

MarcatoreAlleli (Frequenze H PIC alleliche) A1 0 0 A 2 (0,5; 0,5) 0,50 0,375 A 2 (0,4; 0,6) 0,48 0,365 A 2 (0,3; 0,7) 0,42 0,332 A 2 (0,1; 0,9) 0,18 0,164 A 4 (0,25;0,25;0,25; 0,25) 0,75 0,703 A 10 (tutti = 0,1) 0,90 0,891 X 2 (0,5; 0,5) 0,5 0,5 X 4 (0,25;0,25;0,25; 0,25) 0,75 0,75

1) Raccolta famiglie con diagnosi certa di una specifica malattia il cui locus genico è ignoto 2) Costruzione degli alberi genealogici di tutte le famiglie 3) Determinazione del genotipo di tutti gli individui per uno o più marcatori polimorfici 4) Se la famiglia è informativa, si classificano gli individui in ricombinanti o non ricombinanti tra il locus della malattia ed il marcatore analizzato ……… MAPPATURA GENETICA A DUE PUNTI

1 2 MAPPAGGIO GENETICO DEI CARATTERI MENDELIANI Dalle meiosi paterne: i loci A e B sono indipendenti o associati? Non si possono classificare II-2 e tutti gli individui della III generazione rispetto a II-2 (omozigote A 1 A 1 B 1 B 1 )

Sacchetto con monete di tre possibili tipi: TT (monete con T su entrambe le facce), oppure TC, oppure CC 4 lanci: T, T, T, T E’ possibile capire da che tipo di monete è fatto il sacchetto? Ipotesi che siano CC = Scartata Ipotesi possibili: A: che siano TT B: che siano TC Se non si fossero fatti lanci Ipotesi A: Ipotesi B 1:1 Si intende per VEROSIMIGLIANZA di un’ipotesi A, rispetto ad una serie di fatti che costituiscono il risultato R, la probabilità con cui si sarebbe verificato R se A fosse stata vera.

Si confrontano le VEROSIMIGLIANZE di tutte le ipotesi per accertare se una è risultata MOLTO PIU’ VEROSIMILE delle altre Verosimiglianza dell’Ipotesi A = 1 (che siano TT) Verosimiglianza dell’ipotesi B = (1/2) 4 = 1/16 1 Rapporto = 16 :1 1/16 Quanti lanci bisogna fare prima di assumere che siano TT? Si decide una soglia per 2 motivi: 1) ridurre al minimo i casi in cui si accetta per buona un’ipotesi che invece è sbagliata; 2) ridurre al minimo i casi in cui si lascia senza risposta il problema in esame

Rapporto della verosimiglianza = (1- ) 5 x 1 / (1/2) 6 Calcolo del log 10 degli ODD (1- ) 5 x 1 Lod score Z = log (1/2) 6 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Odd 0 3,779 4,287 4,194 1,991 0 Z -  0,577 0,623 0,509 0,299 0 UN ESEMPIO DI CALCOLO DI LOD SCORE NR R Probabilità di meiosi ricombinante = Probabilità di meiosi non ricombinante = (1- ) Probabilità 5 NR e 1R = (1- ) 5 x 1 Probabilità totale in assenza di associazione = (0,5) 6 = (1/2) 6 Caso in cui II 1 ha fase nota R R R R R R

Z = lod score 1000 Z = log = 3 (p=0,05) 1 Z > 3 EVIDENZA DI LINKAGE 1 Z = log = Z < - 2 ESCLUSIONE DI LINKAGE 3 > Z > - 2 NON CONCLUSIVI PER IL LINKAGE SENZA RICOMBINANTI MASSIMO DI LOD SCORE E’ PER = 0 INTERVALLO DI CONFIDENZA (95%): LOD SCORE - 1 es. curva 2 max lod score = 3.7 per = 0.23 limiti fiduciali: LE CURVE DEI LOD SCORE

Per ogni famiglia si calcola: - la verosimiglianza ‘a posteriori’ (sulla base del risultato osservato nelle meiosi) per una serie di ipotesi di associazione (linkage), cioè di valori di ricombinazione  - il valore che si ottiene per ciascun  dell’ODD ratio (= verosimiglianza dell’ipotesi  / verosimiglianza dell’ipotesi di indipendenza) - il Logaritmo degli ODD (= LOD) - i calcola il Lod score complessivo sommando quello di ogni singola famiglia per ogni  - si costruisce il grafico dei Lod score e si individua il valore di  per cui la verosimiglianza è massima COME SI OTTENGONO I VALORI DEL LOD SCORE

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Z -  0,577 0,623 0,509 0,299 0 (1- ) 5 x 1 Lod score Z = log (1/2) 6

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Z -  0,276 0,323 0,222 0,074 0 (1- ) 5 x 1 (1- ) 1 x 5 Z = log (1/2) 6 (1/2) 6 NR NR NR NR NR R R R R R R NR

1) Raccolta famiglie con diagnosi certa di una specifica malattia il cui locus genico è ignoto 2) Costruzione degli alberi genealogici di tutte le famiglie 3) Determinazione del genotipo di tutti gli individui per uno o più marcatori polimorfici 4) Se la famiglia è informativa, si classificano gli individui in ricombinanti o non ricombinanti tra il locus della malattia ed il marcatore analizzato ……… MAPPATURA GENETICA A DUE PUNTI

5) Nel caso di meiosi non informative non è possibile stabilire con certezza gli individui ricombinanti e non ricombinanti e quindi se i due loci sono associati 6) Estensione della tipizzazione a più famiglie Come si stabilisce se i due loci sono associati? 7) Analisi dell’associazione tra il marcatore ed il locus attraverso il calcolo del lod score per ogni singola famiglia 8) Valutazione del lod score complessivo e utilizzazione del criterio statistico per decidere l’associazione o l’esclusione di associazione MAPPATURA GENETICA A DUE PUNTI......

La ricombinazione è una misura della distanza genetica tra due loci Es: loci su cromosomi diversi Es: loci sullo stesso cromosoma con freq ricomb = 0,1

Rispetto alla combinazione parentale (II-1): 5 NR, 2 R Frequenza di ricombinazione = 2/7 = 28,6% 12 STIMA DELLA DISTANZA GENETICA TRA MARCATORI

IL LINKAGE A DUE O PIU’ PUNTI E’ ESSENZIALE PER LA COSTRUZIONE DELLE MAPPE MARCATORE - MARCATORE QUESTO E’ STATO OTTENUTO CON: - COLLEZIONE DI FAMIGLIE CON STRUTTURA IDEALE RACCOLTE A QUESTO SCOPO DAL CEPH DI PARIGI (CENTRE POUR L’ETUDE DES POLYMORPHISMES HUMAINES): 40 famiglie con 3 generazioni e almeno 6 figli) - ANALISI DI MARCATORI POLIMORFICI (SOPRATTUTTO MICROSATELLITI) LOCALIZZATI SU TUTTI I CROMOSOMI IN FAMIGLIE CEPH (1998: mappati 8325 loci microsatelliti) ED ISTITUZIONE DI UNA BANCA DATI - DETERMINAZIONE DELL’ORDINE DEI LOCI NELLE MAPPE MARCATORE – MARCATORE E DEFINIZIONE DELLE DISTANZE IN CENTIMORGAN

ESEMPIO DI FAMIGLIA CEPH

IL PROGETTO GENOMA UMANO PER LA MAPPATURA DEL GENOMA UMANO SONO STATI UTILIZZATI NUMEROSISSIMI MARCATORI POLIMORFICI (RFLP E VNTR), NON NECESSARIAMENTE CORRELATI A GENI ESPRESSI, CON MODALITA’ DI TRASMISSIONE MENDELIANA Utilizzi: 1) Mappatura genetica di loci sconosciuti responsabili di malattie genetiche; 2) Clonaggio genico; 3) Diagnosi prenatale e presintomatica. 23 GRUPPI DI ASSOCIAZIONE (22 AUTOSOMI E CROMOSOMA X)

Analisi della segregazione degli alleli nelle famiglie CEPH. Lod score a due o più punti per stabilire associazione tra marcatori e stimare la distanza genetica in percentuali di ricombinazione che equivalgono ai cM. 1% ricombinazione = 1 unità di mappa = 1 centiMorgan (cM) % Ricombinazione STIMA DELLA DISTANZA GENETICA TRA MARCATORI NEL CROMOSOMA Totale % ricombinazione convertito in 133 cM e quindi in Mb

STIMA DELLA RELAZIONE TRA DISTANZA GENETICA E FISICA Stima della distanza genetica totale nella specie umana: somma della lunghezza totale dei cromosomi ottenuta dalla mappatura genetica attraverso meiosi di origine paterna o materna = 2644 cM (maschio) = 4481 cM (femmina) Per 3000 Mb = 3 x 10 9 bp di genoma Maschio 1 cM = 1.13 Mb = 1.13 x 10 6 bp Femmina 1 cM = 0.67 Mb = 0.67 x 10 6 bp Media : 1 cM = 0.9 Mb = 0.9 x 10 6 bp

Il tasso di ricombinazione non è identico lungo il cromosoma

La distribuzione dei ricombinanti lungo il cromosoma non è casuale e dipende dal sesso

Distribuzione di marcatori associati sul cromosoma 1 e distanza in cM

Mappatura genetica Mappatura fisica bassa risoluzione Mappatura fisica alta risoluzione Mappatura del trascritto Sequenziamento del gene

Esempio di analisi di associazione tra marker M e malattia AD Stima della frequenza di ricombinazione = 2/6 = 0,33

A1A2 Dd A1 D D A2 d d d A3 dd A2 d A3A2 Dd A3 D D A2 d d d A3 dd A2 d A4 Dd A2 D D A4 d d d A2A3 dd A2 d Associazione (linkage) tra il locus marcatore A e locus ignoto di una Malattia Autosomica Dominante in 3 famiglie con la stessa patologia A4 d A2 d L’associazione è tra loci !

MALATTIE PER LE QUALI E’ STATO IDENTIFICATO IL GENE CAUSATIVO TRAMITE CLONAGGIO POSIZIONALE Corea di Huntington Fibrosi cistica Distrofia Muscolare di Duchenne Acondroplasia Tumore del seno (BRCA1, BRCA2) Malattia del rene policistico Atassia spinocerebellare di tipo I, etc Distrofia miotonica Poliposi familiare del colon

ESEMPIO DI CLONAGGIO POSIZIONALE: L’INDIVIDUAZIONE DEL GENE BRCA1 Frequenza tumore al seno in Inghilterra: 1 su 12 donne Casi familiari per mutazione BCRA1 1994: clonaggio di BRCA1. Gene responsabile dell’80-90% dei casi di famiglie affette sia da tumore mammario che alle ovaie. Tumor suppressor gene, mutato anche in altri tipi di cancro 1995: clonaggio di BRCA2. Frequente anche nei casi di tumore mammario nei maschi Comunque solo il 20-25% dei tumori mammari familiari dovuti a questi 2 geni: altri geni con effetto modesto? (eredità poligenica)