DETERMINAZIONE DELLA STRUTTURA PRIMARIA DI BIOPOLIMERI

Sequenziare le proteine La degradazione di Edman E' un metodo molto efficace basato sulla derivatizzazione con PITC (fenilisotiocianato: Ph-N=C=S). Questo permette la rimozione sequenziale e l'identificazione dei residui di amminoacidi a partire dall'N-terminale. Gli errori che si accumulano durante la ripetizione dei vari stadi e le reazioni indesiderate limitano i cicli possibili. Ma il metodo è stato automatizzato ed oggi un sequenziatore in fase gassosa può raggiungere una resa del 98% riuscendo a sequenziare fino a un 70- mero con solo 5-10 picomoli di proteina.

Strategia per il sequenziamento Non è possibile sequenziare un'intera proteina. La strategia seguita è quella di digerire la proteina con enzimi proteolitici per generare oligomeri. Il problema è quello di mettere poi nell'ordine giusto gli oligomeri ottenuti. Si utilizzano quindi due o tre diverse proteasi che generano oligomeri la cui sequenza in parte si sovrappone. Gli oligomeri ottenuti vengono poi separati tramite HPLC e sequenziati. Le zone di sovrapposizione indicheranno la corretta sequenza degli oligomeri nella struttura primaria della proteina. Trypsin Chymotrypsin

Schema della degradazione di Edman

Metodo di Sanger per sequenziare oligonucleotidi (Dideoxynucleotide chain termination) Inizialmente si complessa il primer al templato di DNA (generalmente in singola elica): 3‘-GGAGACTTACAGGAAAGAGATTCAGGATTCAGGAGGCCTACCATGAAGATCAAG-5’ I primer sono utilizzati in molte tecniche di biologia molecolare che richiedono la DNA-polimerasi, come in tecniche di sequenziamento del DNA e nella reazione a catena della polimerasi (PCR). I primer usati in queste tecniche sono dei corti frammenti di DNA, della lunghezza di basi. Questi inneschi sono costruiti in laboratorio, attraverso una sintesi chimica. 5'-GAATGTCCTTTCTCTAA

Poi si divide il campione in 4 aliquote in recipienti designati con "G", "A", "T" and "C" e si aggiungono i seguenti substrati ai rispettivi recipienti: recipiente "G": tutti i 4 dNTP, di cui uno marcato, più ddGTP recipiente "A": tutti i 4 dNTP, di cui uno marcato, più ddATP recipiente "T": tutti i 4 dNTP, di cui uno marcato, più ddTP recipiente "C“: tutti i 4 dNTP, di cui uno marcato, più ddCTP

La presenza di una quantità piccola di dideossinucletide provoca a volte una terminazione della reazione di polimerizzazione.

Se per esempio guardiamo cosa avviene nel recipiente “G”: 5'- GAATGTCCTTTCTCTAAGTCCTAAG 3'-GGAGACTTACAGGAAAGAGATTCAGGATTCAGGAGGCCTACCATGAAGATCAAG-5' 5'-GAATGTCCTTTCTCTAAGTCCTAAGTCCTCCG 3'-GGAGACTTACAGGAAAGAGATTCAGGATTCAGGAGGCCTACCATGAAGATCAAG-5' 5'-GAATGTCCTTTCTCTAAGTCCTAAGTCCTCCGG 3'-GGAGACTTACAGGAAAGAGATTCAGGATTCAGGAGGCCTACCATGAAGATCAAG-5' 5'-GAATGTCCTTTCTCTAAGTCCTAAGTCCTCCGGATG 3'-GGAGACTTACAGGAAAGAGATTCAGGATTCAGGAGGCCTACCATGAAGATCAAG-5' 5'-GAATGTCCTTTCTCTAAGTCCTAAGTCCTCCGGATGG 3'-GGAGACTTACAGGAAAGAGATTCAGGATTCAGGAGGCCTACCATGAAGATCAAG-5' 5'-GAATGTCCTTTCTCTAAGTCCTAAGTCCTCCGGATGGTACTTCTAG 3'-GGAGACTTACAGGAAAGAGATTCAGGATTCAGGAGGCCTACCATGAAGATCAAG-5’ Aggiungendo una polimerasi la reazione procede fino a quando non viene incorporato un dideossinucleotide. Questo evento produce una terminazione di reazione poiché c’è un gruppo 3'H invece di un 3'OH. Poiché il DNA sintetizzato contiene un gruppo marcato (radio) può essere distinto dal templato.

I prodotti ottenuti sono denaturati a singola elica e fatti correre su gel di poliacrilammide/urea. Alla fine il gel asciugato ed esposto ad un film sensibile ai raggi X. Poichè il templato non è radioattivo non sensibilizza il film. Solo gli oligomeri radioattivi vengono visualizzati nel seguente modo: Gli eventi di terminazione producono singole bande nel gel. La terminazione più vicina al templato produce l’oligomero più corto, che migra di più nel gel. Terminazioni susseguenti producono oligomeri vai via più lunghi che possono essere riconosciuti per una minor migrazione. migrazione

Come si presenta una moderna lastrina di elettroforesi su gel per una separazione di oligonucleotidi.

Quando questo processo viene ripetuto sui 4 recipienti ed i risultati dello sviluppo dei gel relativi vengono visualizzati in parallelo, si ottiene una struttura a gradini che indica la sequenza primaria del DNA sintetizzato sulla stampo del templato: