Acidi Nucleici : DNA = acido deossiribonucleico depositario dell’informazione genetica RNA: acido ribonucleico trascrizione e traduzione dell’informazione genetica “dogma centrale della biologia molecolare”

In alcuni virus l’informazione genetica è codificata nel RNA La trascrittasi inversa converte l’RNA virale in DNA e ne permette l’integrazione nel genoma della cellula ospite

Unità costitutive degli acidi nucleici: nucleotidi Base azotata

DNA Citosina Timina RNA Citosina Uracile

DNA Adenina Guanina RNA Adenina Guanina

RNA DNA

Base azotata + zucchero = NUCLEOSIDE H2OH2O

Base azotata + zucchero + fosfato = NUCLEOTIDE Nucleoside Monofosfato

(deossinucleotidi) (nucleotidi)

Base azotata + zucchero + fosfato = NUCLEOTIDE Nucleoside Monofosfato Nucleoside Difosfato Nucleoside Trifosfato

Tutti i nucleotidi assorbono luce ultravioletta

Spettri di assorbimento Nucleotidi (acidi nucleici) Amminoacidi aromatici (proteine)

Gli acidi nucleici sono polimeri lineari di nucleotidi Oligonucleotidi… Polinucleotidi…

Il DNA ha una struttura a doppio filamento l’RNA ha una struttura a filamento singolo DNA RNA Struttura secondaria

Appaiamento complementare delle basi: A-T (2 legami H) C-G (3 legami H) Per ogni molecola di DNA il contenuto di A è uguale al contenuto di T e il contenuto di C è uguale al contenuto di G (regola di Chargaff) Interazioni di van der Waals tra coppie di basi sovrapposte (impilamento – stacking)

Appaiamento complementare delle basi: A-T (2 legami H) C-G (3 legami H)

Conseguenza della complementarietà delle basi… l’informazione contenuta nella sequenza di un filamento è conservata nella sequenza dell’altro …ATGCTAACC…. …TACGATTGG….

Eliche destrorse bp/giro Diametro (Å) Inclinazione basi 6°20° 7° solco maggiore solco maggiore poco più profondo profondo solco minore meno profondo stretto e profondo Elica sinistrorsa (favorita da alternanza purine-pirimidine, es: pCGCGCG….) bp = base pair Kb = migliaia di coppie di basi

Il DNA a doppia elica può essere denaturato

La denaturazione del DNA è un processo reversibile La riassociazione dei filamenti “annealing” è rapida e avviene in una sola tappa se la separazione è incompleta Se i filamenti sono completamente separati la riassociazione avviene in due tappe: 1) appaiamento di un breve segmento complementare (fase più lenta); 2) rinaturazione completa (fase rapida)

La denaturazione si accompagna ad un aumento dell’assorbanza a 260 nm: effetto ipercromico

a

Replicazione del DNA Enzimi coinvolti: DNA polimerasi DNA ligasi elicasi topoisomerasi -Semiconservativa -Bidirezionale -Semidiscontinua Replicazione semiconservativa: Proposta da Watson e Crick

La replicazione del DNA è semiconservativa: Ciascuna molecola figlia È costituita da una catena Parentale e una catena neosintetizzata Esperimento di Meselson-Stahl

Replicazione semiconservativa

Nei procarioti la replicazione del DNA inizia in un unico sito (origine della replicazione) Negli eucarioti la replicazione inizia in più siti Sia nei procarioti che negli eucarioti la replicazione è bidirezionale

La sintesi delle nuove molecole di DNA è catalizzata da DNA polimerasi -Stampo -3’-OH libero (innesco/catena in allungamento) -Nucleosidi 5’-trifosfato (tutti e quattro i nucleotidi devono essere presenti) -Mg 2+

replicazione ricombinazione riparazione Enzima principale della replicazione Processività = numero di nucleotidi aggiunti prima che la polimerasi si dissoci Velocità di replicazione in E. coli = circa 1000 nucleotidi/sec Quante DNA polimerasi?....

Soluzione al problema 1: -sintesi continua nella direzione di avanzamento della forcella di replicazione (filamento guida/catena veloce) -Sintesi discontinua nella direzione di allontanamento dalla forcella di replicazione (catena lenta: frammenti di Okazaki) La replicazione del DNA è semidiscontinua

Problema 2: chi fornisce l’innesco?... Soluzione: DNA primasi: è una RNA polimerasi che sintetizza un breve tratto di RNA (circa 10 nucleotidi) complementare allo stampo di DNA (RNA primer). La DNA primasi utilizza ribonucleosidi 5’- trifosfato e catalizza la formazione del legame fosfodiestere liberando PPi La DNA polimerasi aggiunge poi deossiribonucleotidi all’estremità 3’-OH del RNA primer La DNA polimerasi utilizza deossiribonucleotidi 5’-trifosfato e catalizza la formazione del legame fosfodiestereo liberando PPi

Rimozione del primer e sostituzione con un tratto di DNA da parte della DNA polimerasi I

1.Attivazione del gruppo fosforico 5’ al punto di interruzione 2. Formazione del legame fosfodiestereo DNA LIGASI Reazione a più passggi Saldatura dei frammenti di Okazaki

Negli Eucarioti la replicazione del DNA avviene durante la fase S del ciclo cellulare

La trascrizione è molto simile alla replicazione per quanto riguarda:  Meccanismo chimico  Direzione di sintesi  richiesta di uno stampo

La trascrizione differisce dalla replicazione perché:  Non richiede un primer  Interessa solo brevi segmenti della molecola di DNA  Nel tratto trascritto, uno solo dei filamenti funge da stampo  L’inizio della trascrizione avviene a livello di sequenze specifiche(regione del promotore) riconosciute dalla RNA polimerasi

La trascrizione produce più copie dello stesso gene Funzione del promotore: indica l’inizio del gene che deve essere trascritto

L’RNA polimerasi non ha attività esonucleasica e quindi non può effettuare “proofreading” Frequenza di errore: 1 ogni ribonucleotidi incorporati nell’RNA Elevata processività Le topoisomerasi rimuovono i superavvolgimenti

Negli Eucarioti sono presenti TRE tipi di RNA polimerasi RNA polimerasi I (Pol I)sintesi di RNA pre-ribosomiale (un unico trascritto contenente i precursori di rRNA 18S, 5.8S, 28S RNA polimerasi II (Pol II)sintesi degli mRNA RNA polimerasi III (Pol III)sintesi dei tRNA, rRNA 5S piccoli RNA Come avviene la trascrizione negli Eucarioti?....

di inizio Fattori di trascrizione (TF) proteine che regolano la trascrizione, ma non sono subunità della RNA polimerasi promotore

Modificazioni post-trascrizionali degli mRNA eucariotici (maturazione degli mRNA) Aggiunto prima che la sintesi del trascritto primario sia completata Introni = sequenze non codificanti (eliminati con lo splicing) Esoni = sequenze codificanti

cappuccio 5’: - Protegge l’mRNA dalle ribonucleasi - Viene riconosciuta da proteine che legano il ribosoma -guanililtransferasi (nucleo) – da GTP -guanina 7-metiltransferasi (citoplasma) Coda di poliA ( nucleotidi) Aggiunta dalla poliadenilato polimerasi (nucleo) Stabilizza l’mRNA Ne favorisce l’uscita dal nucleo

Splicing alternativo snRNP = piccole particelle ribonucleoproteiche nucleari (proteine + snRNA) SPLICING: eliminazione degli introni

TRADUZIONE Il linguaggio a 4 lettere (basi) del DNA/RNA viene tradotto nel linguaggio a 20 lettere (amminoacidi) delle proteine

Codone = tripletta di nucleotidi codificante per un amminoacido Caratteristiche del codice genetico: Codice a triplette Ridondante (o degenerato) (codoni sinonimi) Specifico (non ambiguo) Universale Non sovrapposto Privo di punteggiatura

Il tRNA ha la funzione di “traduttore”(o adattatore) Per ogni amminoacido c’è almeno un tRNA specifico Negli Eucarioti sono presenti circa 50 specie di tRNA

Il riconoscimento codone-anticodone avviene secondo le regole dell’appaiamento complementare e antiparallelo Le prime due basi dell’anticodone formano sempre appaiamenti stabili, mentre la terza base forma appaiamenti più deboli (base oscillante, wobble). Conseguenza funzionale: un dato tRNA può riconoscere più di un codone

Caratteristiche strutturali del t-RNA -Lunghezza: nucleotidi -Residuo pG all’estremità 5’ (nella maggior parte dei t-RNA) -Sequenza CCA all’estremità 3’ -Struttura secondaria a trifoglio -Presenza di basi modificate nelle regioni non appaiate -Struttura tridimensinale a “L” ribaltata  = pseudouridina I = inosina T= ribotimidina D = 5,6-diidrouridina m 1 I= 1-metilinosina m 1 G= 1-metilguanosina m 2 G= N2-dimetilguanosina (Ala) Ansa D Ansa Dell’anticodone Ansa variabile Ansa T  C

Step 1: attivazione dell’amminoacido + H 2 O2Pi

Step 2: formazione dell’amminoacil-tRNA

Il legame tra il t-RNA e l’amminoacido corrispondente è catalizzato dalle amminoacil-tRNA sintetasi Per ogni coppia tRNA-amminoacido esiste una amminoacil-tRNA sintetasi specifica Le amminoacil-tRNA sintetasi hanno attività di “correzione delle bozze”

Che cosa determina il corretto posizionamento del mRNA sui ribosomi?... Nei Procarioti: Sequenza di Shine-Dalgarno Negli Eucarioti : la subunità 40S si lega al cappuccio presente all’estremità 5’ dell’mRNA e poi si sposta fino ad incontrare il codone di inizio. PAB = proteina che lega il poli-A eIF = eukaryotic Initiation Factor

Tappe della sintesi proteica 1.Inizio 2.Allungamento 3.Terminazione Assemblaggio dei componenti del sistema di traduzione IF = fattori di inizio P= sito peptidilico A = sito amminoacilico

Tappe della sintesi proteica 1.Inizio 2.Allungamento 3.Terminazione Assemblaggio dei componenti del sistema di traduzione Nei procarioti il primo amminoacido è formil-Metionina, trasportato dal formil-Met-tRNA Negli eucarioti la sintesi comincia con Met. Solo il fMet-tRNA si lega prima al sito P Tutti gli altri amminoacil-tRNA si posizionano prima nel sito A e solo successivamente nel sito P e nel sito E

Tappe della sintesi proteica 1.Inizio 2.Allungamento 3.Terminazione Assemblaggio dei componenti del sistema di traduzione E= sito di uscita (tRNA scarichi) P= sito peptidilico A = sito amminoacilico Sia la subunità minore che la subunità maggiore contribuiscono alla formazione dei siti P e A Il sito E è localizzato completamente sulla subunità maggiore COMPLESSO DI INIZIO

Tappe della sintesi proteica 1.Inizio 2.Allungamento 3.Terminazione Posizionamento del secondo amminoacil-tRNA nel sito A Formazione del legame peptidico Traslocazione

Tappe della sintesi proteica 1.Inizio 2.Allungamento 3.Terminazione Formazione del legame peptidico catalizzata dall’attività peptidil-transferasica dell’ RNA 23S (ribozima)

Tappe della sintesi proteica 1.Inizio 2.Allungamento 3.Terminazione traslocazione

Tappe della sintesi proteica 1.Inizio 2.Allungamento 3.Terminazione Si libera la proteina completa I ribosomi, l’mRNA, i tRNA, i vari fattori proteici possono essere riutilizzati nella sintesi di un altro polipeptide RF = Fattori di rilascio

Una molecola di mRNA può essere tradotto simultaneamente da numerosi ribosomi (polisomi) La catena polipeptidica comincia a ripiegarsi già durante la sintesi Può andare incontro a modificazioni dopo il completamento della sintesi La proteina finale – ripiegata nella sua conformazione nativa – è biologicamente attiva