La genetica dei tumori

L’aumento dei casi di CANCRO nel XX secolo, è una conseguenza di vari fattori: - la diminuzione delle malattie infettive - l’allungamento della vita - l’aumento degli inquinanti ambientali

È considerata cancerosa una cellula che ha perso il controllo della sua crescita L’origine del cancro è CLONALE (si origina cioè da una SINGOLA CELLULA) -> si tratta di una cellula SOMATICA che ha accumulato MUTAZIONI in diversi geni che provocano la perdita del CONTROLLO DELLA PROLIFERAZIONE CELLULARE Alcuni tumori continuano a crescere nel sito di origine, altri producono cellule che migrano in altri siti e generano tumori secondari (METASTASI)

Sono state identificate finora più di 200 tipi di sindromi cancerose che interessano quasi tutti i tipi di cellule, tessuti e organi Un tipo di cancro viene di solito classificato secondo il suo sito di insorgenza iniziale (primario): 85% sono carcinomi e si orginano da cellule che costituiscono organi e tessuti I tipi di cancro dei tessuti ghiandolari si dicono adenocarcinomi e quelli delle cellule non neuronali dell’encefalo sono i gliomi e astrocitomi. 2% sono sarcomi che si originano da cellule del tessuto connettivo, osseo, muscolare 5% sono linfomi che si originano da leucociti della milza e dei linfonodi 3% sono leucemie che si originano da leucociti del sangue I mielomi sono i tumori delle cellule plasmatiche

Relazione tra età e frequenza di tumori La frequenza di molti tumori aumenta esponenzialmente con l’età. Riportando la frequenza dei tumori in funzione dell’età dei pazienti, la relazione risulta LINEARE

Un tumore deriva da divisioni ripetute Un cambio nel DNA di una sola cellula è responsabile dell’insorgenza del tumore (origine monoclonale) Un tumore deriva da divisioni ripetute di un’unica cellula mutante che ha perduto la regolazione della crescita L’origine CLONALE di un tumore è stata proposta a seguito di alcune osservazioni: Femmine con vari tipi di tumori ed eterozigoti per i due alleli della G6PD, nelle loro cellule esprimono solo uno dei due alleli 2) In alcune LEUCEMIE MIELOIDI compare sempre un cromosoma 22 più piccolo -> chiamato cromosoma Philadelphia. Questa particolare anomalia è riscontrata in tutte le cellule tumorali del soggetto che presenta la leucemia

La continua proliferazione delle cellule TRASFORMATE di un clone porta ad accumulo di ANOMALIE CROMOSOMICHE: cromosomi aggiuntivi, mancanti, delezioni, duplicazioni e traslocazioni. Le anomalie cromosomiche, riscontrate nelle cellule cancerose dello stesso individuo o tra individui che presentano lo stesso tipo di cancro, possono essere diverse. L’accumulo di anomalie cromosomiche è chiaramente una conseguenza della divisione cellulare incontrollata

Questi aspetti sono stati chiariti negli anni ‘70 È stata necessaria la convergenza di vari approcci per porre le basi per la comprensione delle BASI MOLECOLARI DEL CANCRO: analisi citogenetiche per le leucemie nell’uomo studi su forme di cancro indotte da retrovirus in roditori e altri animali tecniche del DNA ricombinante Era noto già all’inizio del XX secolo che nelle cellule cancerose erano presenti delle ANOMALIE CROMOSOMICHE. Alcuni però sostenevano che sia la perdita di cromosomi che le anomalie strutturali fossero le conseguenze del cancro. Altri ipotizzavano che ne fossero la causa. Questi aspetti sono stati chiariti negli anni ‘70

A parte l’elevato numero di anomalie cromosomiche casuali che si ritrovano nelle cellule cancerose, un piccolo numero di ABERRAZIONI CROMOSOMICHE si ritrovano regolarmente in alcuni tipi di tumore, in particolare nelle leucemie. Un esempio è la Leucemia Mieloide Cronica (CML) che risulta frequentemente associata all’apparente delezione del braccio lungo del cromosoma 22. Il cromosoma 22 anomalo in questa malattia è stato denominato cromosoma “Philadelphia” Il cromosoma Philadelphia in realtà è il prodotto di una traslocazione reciproca tra il cromosoma 22 e il cromosoma 9 oppure il cromosoma 8

Associazione tra traslocazioni cromosomiche e leucemie umane Studi sui cariotipi di cellule tumorali rivelarono che alcune forme di cancro avevano LE STESSE ABERRAZIONI CROMOSOMICHE. L’esempio più impressionante era offerto proprio dalla Leucemia Mieloide Cronica (CML) in cui più del 90% dei pazienti avevano una traslocazione tra i cromosomi 9 e 22 oppure 8 e 22 ( cromosoma precedentemente denominato Philadelphia). Anche in altre leucemie furono osservate specifiche traslocazioni ma non nella misura del cromosoma Philadelphia nei pazienti con CML Leucemia Traslocazione cromosomica L’associazione di specifiche anomalie cromosomiche a specifiche forme di cancro indicava un’associazione di causa-effetto. Non si sapeva però quali geni fossero alterati o deregolati dalle varie traslocazioni

I ricercatori sapevano da anni che numerosi virus, sia a DNA che ad RNA, specie-specifici potevano causare forme di cancro in vari organismi anche se raramente sono la causa di cancro nell’uomo. Questi virus sono stati estremamente utili per la comprensione dell’origine genetica del cancro nell’uomo. Virus del sarcoma di Rous (RETROVIRUS) determina l’insorgenza del sarcoma nel pollo

Generico ciclo vitale di un retrovirus LTR GAG POL ENV Proteine strutturali interne Glicoproteine dell’involucro esterno Reverse trascrittasi Glicoproteine dell’involucro esterno Proteine strutturali interne Reverse trascrittasi RNA del virus

Virus del sarcoma di Rous La capacità trasformante del virus del sarcoma di Rous era SEPARABILE dalla capacità riproduttiva del virus che determinava il tumore Questo gene è stato identificato ed è stato chiamato v-src; è stato anche definito ONCOGENE perché quando introdotto in una cellula la poteva trasformare. LTR GAG POL ENV V-SRC LTR LTR GAG POL ENV LTR Si vide poi in seguito che questo gene era presente anche nel genoma di pollo ed a questo è stato dato il nome di c-src ed è stato definito un proto-oncogene. Il retrovirus normale durante un ciclo di infezione nelle cellule di pollo si è portato dietro un pezzo del genoma dell’ospite contenente il gene c-src e si è trasformato in un virus oncogeno. Tra le due sequenze ci sono delle differenze che sono la causa del tumore: il protooncogene, presente normalmente nelle cellule dell’organismo, in seguito al suo passaggio nel genoma virale, ha subito mutazioni ed è quindi diventato un ONCOGENE

Anomalie relative alla membrana plasmatica Cambiamenti nelle cellule in coltura trasformate da virus oncogeni Anomalie relative alla membrana plasmatica Aumento del trasporto di metaboliti Elevata produzione di attivatore del plasminogeno che esalta la proteolisi extracellulare Eccessiva bollosità della membrana plasmatica Anomalie della adesività Diminuita adesione alle superfici, le cellule rimangono tondeggianti Incapacità dei filamenti di actina di organizzarsi in grossi fasci Scarsa deposizione di fibronectina extracellulare Anomalie nell’accrescimento e nella divisione Accrescimento sino a raggiungere una densità cellulare insolitamente alta Diminuita richiesta di fattori di accrescimento nel siero Diminuita necessità di ancorarsi (le cellule possono crescere senza necessità di distendersi su una superficie solida) Le cellule provocano tumori se vengono iniettate in animali sensibili

Alcuni virus oncogeni Retrovirus v-oncogene origine Tipo di cancro Virus del sarcoma di Rous v-src Pollo Sarcoma Virus del sarcoma dei felini v-fes Felini Sarcoma Virus della mieloblastosi aviaria v-myb Pollo Mieloblastosi Virus della mieloblastosi aviaria v-myc Pollo Leucemia MC29 Virus del sarcoma aviario v-yes Pollo Sarcoma Virus del sarcoma Gardner-Rashid v-fgr Felini Sarcoma dei felini Virus del sarcoma della scimmia v-sis Scimmia Sarcoma Virus dell’osteosarcoma murino v-fos Topo Osteosarcoma di Finkel,Biskis e Jinkins Virus dell’eritroblastosi aviaria v-erbA Pollo Eritroblastosi Virus di Sloan-Kettering v-ski Pollo Carcinoma Virus della leucemia murina v-abl Topo Leucemia di Abelson Virus del sarcoma aviario UR2 v-ros Pollo Sarcoma Virus del sarcoma murino v-mos Topo Sarcoma di Moloney Virus della reticoloendoteliosi aviaria v-rel Tacchino Leucosi linfoide Virus del sarcoma murino di Harvey v-Hras Ratto Sarcoma Virus del sarcoma murino di Kirsten v-Kras Ratto Sarcoma

Gli ONCOGENI identificati nei retrovirus hanno omologhi nei genomi di tutti i vertebrati compreso l’uomo, questi geni sono stati chiamati proto-oncogeni Come mai gli organismi mantengono certi geni che possono risultare pericolosi?

Proliferazione cellulare e cancro Durante lo sviluppo di un organismo ci sono molti processi finemente controllati che regolano il numero delle divisioni cellulari e che, se alterati, possono provocare il cancro: - proliferazione cellulare - quiescenza - apoptosi - l’ attivazione di cellule quiescenti ad opera di fattori extracellulari (FATTORI DI CRESCITA) Dopo l’embriogenesi, in condizioni normali, la maggior parte delle cellule sono in uno stato di quiescenza, detto G0, durante il quale non si dividono. Alcune continuano a dividersi secondo necessità e l’APOPTOSI assicura che non ci sia un eccessivo accumulo di cellule in alcuni tessuti o organi

Proliferazione cellulare in condizioni di normalità Interphase G0 Fattori di crescita attraverso vie di trasduzione del segnale ATTIVANO il passaggio delle cellule dallo stato G0 al G1 Si stabilisce un equilibrio tra proliferazione, stato di quiescenza e apoptosi

Via di trasduzione del segnale mediata da ras ELK1 FOS JUN DNA del gene ras Gly Ala Gly Gly Val Gly di tipo selvatico GGC GCC GGC GGT GTG GGC DNA dell’oncogene ras GTC Amminoacido 10 Amminoacido 15 Se c’è una mutazione nel gene ras…….. La proteina Ras risulta sempre attiva Ras si ATTIVA

È attivata una serina/treonina chinasi a valle Attivazione di ras Ras inattiva Ras attiva L’interazione con SOS stimola lo scambio GDP-GTP L’oncoproteina Ras resta bloccata nello stato attivo se c’è la mutazione e il segnale diventa continuo È attivata una serina/treonina chinasi a valle GAP NF-1 Forma sempre attiva anche senza segnali esterni (via della trasduzione del segnale)

Espressione delle cicline durante il ciclo cellulare La ciclina D1 si accumula precocemente nella fase G1 ed è espressa a livelli costanti La ciclina E si accumula in G1 raggiunge un picco e diminuisce a metà della fase S La ciclina D2 inizia ad accumularsi nella seconda metà di G1 raggiunge un picco La ciclina A compare in tarda fase G1, si accumula in fase S; ha un picco nel momento di transizione G2/M e diminuisce rapidamente in fase M La ciclina B segue un po’ sfalsata la ciclina A

Ciclina B La ciclina B inizia ad accumularsi in fase S; ha un picco nel momento di transizione G2/M e diminuisce rapidamente in fase M: la ciclina B favorisce il passaggio alla mitosi La transizione dalla fase G2 alla fase M è controllata dalla ciclina B e da un’altra proteina: CDK1. Queste molecole interagiscono per formare un complesso che fosforila componenti cellulari. Questi a loro volta danno origine ai cambiamenti biochimici e strutturali necessari per la mitosi

Funzioni dei protooncogeni (ciclo cellulare) Fattori di crescita (PDGF->sis) Recettori dei fattori di crescita recettori per PDGF, EGF ->erb-B Proteine Kinasi associate alle membrane src C-kinase Trasduzione del segnale H-ras Kinasi citoplasmatiche raf Fattori di trascrizione jun Proteine che promuovono la proliferazione cellulare Altri fattori di trascrizione fos DNA

-fattori di crescita (sis) e recettori (erb-B) Fattore di crescita -fattori di crescita (sis) e recettori (erb-B) -proteine kinasi (src) -trasduzione del segnale (H-ras) -fattori nucleari (myc, fos, jun ecc.) C

Aberrazioni cromosomiche e tumori Ciò che fu fondamentale per compiere un grosso passo in avanti nell’identificazione di quali geni fossero alterati nelle traslocazioni eventualmente responsabili dei tumori, fu la scoperta che la posizione dei PROTO-ONCOGENI umani omologhi agli oncogeni virali coincidessero con i punti di rottura della traslocazioni presenti in varie leucemie. L’oncogene v-abl (gene ritrovato nel virus della leucemia murina di Abelson) identificava il gene ABL umano omologo localizzato sul cromosoma 9 in posizione 9q34.1 che corrisponde proprio al sito coinvolto nella traslocazione del cromosoma Philadelphia e che codifica per una fattore di trasduzione del segnale. Si poteva quindi dedurre che fosse proprio un’alterazione del gene ABL a contribuire alla leucemia.

Cromosoma Philadelphia Traslocazione In realtà la traslocazione t (9;22) determina la fusione del proto-oncogene c-ABL con il gene BCR, sul cromosoma 22 (è una serina-treonina chinasi, la cui funzione non è ancora completamente chiarita). La proteina ABL ha attività di tirosina-chinasi e quindi la proteina di fusione è una potente molecola ibrida che attiva impropriamente vie di trasduzione del segnale e porta le cellule a sfuggire al controllo del ciclo cellulare, contribuendo allo sviluppo della Leucemia Mieloide Cronica (CML)

Gene di fusione che si origina a seguito della traslocazione t (9;22) La traslocazione corrispondente al cromosoma Philadelphia (Ph1) crea un gene chimerico che ha il promotore e la prima parte del gene BCR, viene sempre espresso e determina la: LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA

Conseguenze di varie traslocazioni che coinvolgono il gene myc Queste traslocazioni portano il gene myc in vicinanza di enhancer per l’espressione delle catene sia leggere che pesanti delle immunoglobuline, lasciando quindi che il gene myc si esprima costitutivamente LINFOMA DI BURKITT

Gene Bcl-2 e la leucemia linfocitica cronica (CLL) Cromosoma umano 14 umano 18 Traslocazione 14,18 Centromero Punto di rottura Enhancer dell’ IGH Gene per la catena pesante dell’immunoglobulina IGH Gene bcl-2 Non attivo nei linfociti Punto di rottura Riunione dei punti di rottura Attivo nei linfociti B Il gene bcl-2 risulta sempre attivato nei linfociti (in cui normalmente non è espresso), il gene bcl-2 è importante per l’apoptosi e di conseguenza l’apoptosi in queste cellule è bloccata

Bcl-2, BAX, p53 e controllo dell’apoptosi Globulo bianco che sta andando incontro ad apoptosi Globulo bianco normale Le concentrazioni relative delle proteine Bcl-2 e BAX regolano l’apoptosi. Una cellula normale contiene Bcl-2 e BAX in equilibrio, che formano eterodimeri inattivi. Un eccesso di Bcl-2 dà origine a omodimeri BCL-2, che prevengono l’apoptosi. Le cellule tumorali che sovraesprimono Bcl-2 sono resistenti alle chemioterapie e alla radioterapia. Un eccesso relativo di BAX dà origine a omodimeri BAX che inducono l’apoptosi. Nelle cellule normali, la proteina p53 attivata induce la trascrizione di BAX e inibisce la trascrizione di BCL-2, portando la cellula alla morte. In molte cellule tumorali, la p53 è difettiva per cui è preclusa la via che rimuove le cellule tumorali tramite l’apoptosi

Oncogene Funzione Cancro nella cellula normale

Oncogeni H-ras c-erbB c-myc c-fos c-kit c-raf RAR- E6 MDM2 cicline Protooncogene funzione normale Alterazioni nel cancro Tumori associati H-ras c-erbB c-myc c-fos c-kit c-raf RAR- E6 MDM2 cicline CDK2;4

ONCOGENI -> agiscono in maniera dominante; sono causa di forme sporadiche di tumori Fattori di crescita (GF) Recettori dei fattori di crescita Componenti della trasduzione del segnale intracellulare (ras) Fattori di trascrizione (myc) Regolatori del ciclo cellulare (cicline)

Meccanismi di attivazione degli oncogeni Amplificazione genica Mutazioni puntiformi Creazione di geni chimerici (traslocazione 9; 22), come BCR-ABL Traslocazione di geni in regioni cromosomiche trascrizionalmente attive (myc-IGH) Differenti tipi di alterazioni genomiche possono avere effetti oncogeni.

Oltre alle proteine necessarie per l’attivazione della proliferazione cellulare, del ciclo di divisione e dell’apoptosi ce ne sono altre che controllano le proteine attivatrici e ce ne sono ancora altre che sono necessarie a riparare eventuali danni a carico del DNA genomico e contribuire così a prevenire il cancro (ANTIONCOGENI).