Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) Ionization Methods (Nobel, e-museum) Nobel Prize in Chemistry 2002 Electrospray Ionization John B. Fenn Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) Koichi Tanaka

Classi di analizzatori di massa A settore magnetico A doppia focalizzazione A quadrupolo (lineare) Trappola ionica a quadrupolo A tempo di volo Trasformata di fourier

Magnetic Sector Analyzer

Analizzatore a settore magnetico Spettrometro di massa a focalizzazione semplice Di solito la sorgente è a EI o CI 60, 90 o 180° 1 2 B Schermo metallico + Lo spettro si registra facendo una scansione di V o di B. La scansione di V permette di usare magneti permanenti per la generazione del campo B. Normalmente gli strumenti commerciali sono a scansione di V. m, z V Ioni più pesanti 10-7 torr Ioni più leggeri Rivelatore R < 2000, perché gli ioni entrano nel settore magnetico con una distribuzione di energie cinetiche, e quindi di velocità.

Analizzatore elettrostatico Energia cinetica 1 2 Forza centripeta + + E m, z V r - Per potere attraversare la fenditura, gli ioni devono avere una determinata velocità. L’analizzatore elettrostatico non è un analizzatore di massa, ma un filtro di velocità, per cui viene utilizzato in combinazione con un analizzatore di massa per aumentarne la risoluzione.

Analizzatore di massa a quadrupolo Massimo valore m/z ~ 4 000 Risoluzione ~ 3 000 I quadrupoli sono strumenti a bassa risoluzione Si lavora normalmente alla risoluzione di una unità di massa. Leggero, di dimensioni contenute Facile da accoppiare alla cromatografia Efficiente trasmissione degli ioni Necessaria una elevata precisione nell’allineamento delle barre degli elettrodi

Quadrupoles have variable ion transmission modes mass scanning mode m1 m3 m4 m2 single mass transmission mode m2 m3 m1 m4

Analizzatore di massa a quadrupolo Potenziale nel quadrupolo

Lo spettro di massa Spettro di massa multicarica (ESI/qTOFMS) m/z Albumina del siero bovino: Mr = 64 000

The Ion Trap

Traiettorie ioniche nella trappola a quadrupolo Moto degli ioni in direzione z Moto degli ioni in direzione r tempo Gli ioni vengono intrappolati forzandoli su traiettorie chiuse stabili all’interno della trappola. Quando la traiettoria di uno ione diventa instabile, questo esce dalla trappola e viene rivelato.

Substituting the above equation in equation 6 and differentiating with respect to x, For description of the stability diagrams of the quadrupole ion trap, az and qz are frequently used.   Since u equals x,   As listed above, the equation for az has a negative sign. This explains the difference in a stability diagram for a quadrupole ion trap when compared to the stability diagram for a quadrupole.

Analizzatore a tempo di volo (TOF) Zona di accelerazione con campo elettrostatico E Ioni positivi Sorgente d V = 0 dE = V0 = 20 000 V V = V0 L

The m/z ratio is related to flying time Theory of TOF-MS v2 = 2 V z m Transit time (t) is L/v, where L is drift tube length and v is velocity t = L v t2 = L2 m 2 z V m/ z = 2 t2 V L2 The m/z ratio is related to flying time

Time-of-flight (TOF) Mass Analyzer Source Drift region (flight tube) + + detector + + V Ions are formed in pulses. The drift region is field free. Measures the time for ions to reach the detector. Small ions reach the detector before large ones.

How do we achieve superior mass resolution? Reflector TOF Mass Analyzer Delayed Extraction on a MALDI source

Voyager-DE STR MALDI TOF Sample Linear Extraction plate Reflector detector grids Timed ion detector selector Reflector Laser Camera Pumping Pumping

Reflectron TOF Reflectron TOF a stadio singolo Metodo per correggere la distribuzione di velocità, diminuendo Δt Sorgente Reflectron TOF a stadio singolo

Analizzatore di massa a tempo di volo Massimo valore m/z > 200 000 Risoluzione fino a 10 000 – 20 000. Il reflectron consente di: Ridurre le dimensioni Aumentare la risoluzione Ideale accoppiamento con sorgenti pulsate Efficiente trasmissione degli ioni

The mass spectrum shows the results MALDI TOF spectrum of IgG MH+ 10000 20000 30000 40000 Relative Abundance (M+2H)2+ (M+3H)3+ 50000 100000 150000 200000 Mass (m/z)

ESI Spectrum of Trypsinogen (MW 23983) M + 15 H+ 1599.8 M + 16 H+ M + 14 H+ 1499.9 1714.1 M + 13 H+ 1845.9 1411.9 1999.6 2181.6 m/z Mass-to-charge ratio

LTQ Orbitrap Operation Principle 1. Ions are stored in the Linear Trap 2. …. are axially ejected 3. …. and trapped in the C-trap 4. …. they are squeezed into a small cloud and injected into the Orbitrap 5. …. where they are electrostatically trapped, while rotating around the central electrode and performing axial oscillation The oscillating ions induce an image current into the two outer halves of the orbitrap, which can be detected using a differential amplifier Ions of only one mass generate a sine wave signal

LTQ-FT specs Resolution 100 000 resolution at m/z 400 at 1 Hz repetition rate >500 000 resolution broadband mode Mass Range m/z 50-4000 (standard range) 1-order-magnitude in single scan (e.g. m/z 400-4000) Mass Accuracy 2 ppm RMS, external mass calibration <1 ppm RMS, internal mass calibration Dynamic Range >500 000 between mass spectra 5000 within mass spectrum IRMPD ECD

B q B m =  m So we can calculate the mass of the ion We know the Once the ion is trapped, So we can calculate the mass of the ion the magnet bends it into We know the a circular path. Magnetic Field B q B m =  We measure the frequency m “Light” Ions have a High frequency “Heavy” Ions have a Low frequency

Differential Amplifier Time (ms) 800 700 600 500 400 300 200 100 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 -0.01 -0.02 -0.03 -0.04 -0.05 Time-Domain Transient Image Current Differential Amplifier As the spiraling ion gets near The signal is recorded for a detect plate, it induces a a period of time and then current that is detected by displayed by the software our instrument.

Time-Domain Transient Time (ms) 800 700 600 500 400 300 200 100 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 -0.01 -0.02 -0.03 -0.04 -0.05 Time-Domain Transient Image Current A Fourier Transform then converts the “time” domain signal into all the frequencies that compose the “time” signal We know how frequency relates to mass, so we convert to the “Mass Spectrum” Frequency (kHz) 300 250 200 150 100 50 FT Frequency Spectrum m z A  = + B 2 m/z 1400 1300 1200 1100 1000 900 800 700 600 500 Mass Spectrum

Rivelatori di ioni Lastre fotografiche Coppa di Faraday Ad AgBr. Sono state i primi rivelatori di ioni Coppa di Faraday Un semplice elettrodo collettore schermato Economico, poco sensibile Rivelatori a scintillazione A cristalli di materiale fosforescente Moltiplicatori di elettroni A dinodi separati A dinodo continuo

Moltiplicatori di elettroni Moltiplicatore a dinodi separati Fascio di ioni All’amplificatore Fenditura Elettroni – Cascata di elettroni + + – – + Superficie conduttrice a resistenza variabile 2kV Collegamento a terra attraverso l’amplificatore Moltiplicatore a dinodo continuo

Tandem MS 10/27/2017 Analytical Assays used in Pharmaceutical Industry Labs for New Chemical Entities Method 1990 1998 2000 2006 HPLC (UV &Fluorescence) 75% 50-60% 20% 2% GC/MS 12% 3% LC/MS/MS 40-50% 60-75% 98% Immunoassay (ELISA/FPIA etc.) 10% table Dr. Edward Randell