Rilevare un SNP mediante amplificazione con PCR Se l’ SNP riguarda un sito di restrizione POLIMORFICO e se è nota la sequenza che si trova ai lati del sito di restrizione, il polimorfismo può essere determinato attraverso la PCR in 3 passaggi: 1) amplificazione della regione polimorfica compresa tra i due primers (alcune centinaia di coppie di basi) 2) esposizione del prodotto di amplificazione all'enzima di restrizione per cui il sito è polimorfico 3) analisi dei frammenti ottenuti su gel di agarosio. Allele emoglobina A normale Glu Pro CCT GAG GAG GGA CTC CTC Upper primer Lower primer amminoacido n. 6 modificato Sito Mst II Sito di restrizione assente Allele emoglobina S anemia falciforme (in questo caso l’SNP riguarda una sequenza CODIFICANTE) Val Pro Glu CCT GTG GAG GGA CAC CT C Eterozigote Omozigote S Omozigote A 500 bp 300 bp 200 bp La lunghezza totale del frammento amplificato è di circa 500 bp -> se il sito è presente (allele A, normale) si produrranno due frammenti di 200 e 300 bp; se il sito è assente (allele S, mutato) si produrrà un unico frammento di 500 bp

Trasmissione ereditaria di un allele RFLP associato ad un carattere che si trasmette come un carattere AUTOSOMICO DOMINANTE sonda L’esame dell’albero ed il Southern indicano che i figli colpiti hanno ereditato un cromosoma che porta l’allele A. Se questa modalità viene confermata in grandi famiglie ed in più generazioni, l’allele mutato relativo alla PATOLOGIA è localizzato sullo stesso cromosoma dell’allele A.

Strategia per associare un RFLP o un altro MARCATORE polimorfico ad un locus cromosomico che può essere responsabile di una malattia È necessario disporre di : una famiglia numerosa con più generazioni in cui sia presente e trasmessa una patologia genetica una raccolta di sequenze clonate che rilevi gli RFLP (almeno una per ogni cromosoma umano). Si costruisce un albero genealogico per determinare le modalità di trasmissione del carattere e per identificare i membri colpiti. Si analizzano poi i marcatori RFLP specifici dei singoli cromosomi, nei componenti della famiglia. Se la patologia genetica ed il marcatore RFLP specifico del cromosoma vengono ereditati insieme in varie generazioni, la patologia genetica e l'RFLP devono essere vicini sullo stesso cromosoma.

Mappatura di un gene associato ad una malattia mediante RFLP Mutazione (Dominante) responsabile della malattia X a localizzazione sconosciuta GENITORE A portatore del gene per la malattia X Cromosoma del genitore che ha la malattia Durante le meiosi dell’individuo, ce ne saranno alcune in cui non avverrà la ricombinazione ed altre in cui questa avverrà e ci saranno nuove combinazioni di alleli Per ogni cromosoma umano sono attualmente disponibili decine di marcatori RFLP In seguito alla FECONDAZIONE molti individui della generazione successiva presentano la malattia X ed i marcatori RFLP c Ogni volta che si eredita la malattia sul cromosoma 6 è presente il marcatore RFLP c; quando c’è l’allele c’ l’individuo è sano!

Identificazione di SNPs che non sono localizzati in siti di restrizione

ASO - PCR (Allele Specific Oligonucleotides-PCR) Si usa questa tecnica preferenzialmente se l’SNP polimorfico non riguarda un SITO DI RESTRIZIONE Usando sonde molto corte (ad esempio oligonucleotidi fino a 20 basi) è possibile evidenziare cambiamenti di UNA SOLA BASE dopo ibridazione. Allele 1 5’ 3’ Individuo 1 OMOZIGOTE per l’allele 1 Allele 2 Individuo 3 OMOZIGOTE per l’allele 2 Individuo 2 ETEROZIGOTE 5’ GACTCCTGTGGAGAAGTGC 3’ ASO per l’allele 2 5’ GACTCCTGAGGAGAAGTGC 3’ ASO per l’allele 1 Amplificazione con primer esterni al polimorfismo/ mutazione dei campioni provenienti da diversi individui Amplificazione individuo 1 Amplificazione individuo 2 Amplificazione individuo 3 Questo filtrino sarà ibridato solo con ASO 1 marcato Questo filtrino sarà ibridato solo con ASO 2 marcato 1 2 3 Aliquote degli amplificati sono deposte su filtrini di nitrocellulosa da ibridare con gli ASO diversi

Il campione 2 ibrida sia con ASO 1 che con ASO 2 quindi è ETEROZIGOTE Allele 1 5’ 3’ OMOZIGOTE per l’allele 1 Allele 1 5’ 3’ Allele 2 ETEROZIGOTE Allele 2 5’ 3’ OMOZIGOTE per l’allele 2 Individuo 1 Individuo 2 Individuo 3 Questo filtrino sarà ibridato solo con ASO 1 marcato Questo filtrino sarà ibridato solo con ASO 2 marcato Denaturazione dei campioni e spot su un filtrino di nitrocellulosa Lavaggi ed esposizione 1 2 3 Il campione 1 ibrida solo con ASO 1 e non con ASO 2 quindi è OMOZIGOTE per l’allele 1 Il campione 3 ibrida solo con ASO 2 e non con ASO 1 quindi è OMOZIGOTE per l’allele 2 Il campione 2 ibrida sia con ASO 1 che con ASO 2 quindi è ETEROZIGOTE

Determinazione di alleli che cambiano le dimensioni di un locus: i MICROSATELLITI ed i MINISATELLITI A parte gli SNPs che causano variazioni della SEQUENZA del DNA, gli altri polimorfismi causano variazioni nella LUNGHEZZA Alleli che differiscono per le dimensioni possono essere distinti e facilmente analizzati tramite ELETTROFORESI SU GEL

Determinazione di polimorfismi di lunghezza: I MICROSATELLITI Si determinano le sequenze UNICHE che fiancheggiano il microsatellite per disegnare i PRIMERS per l’amplificazione con PCR Allele 1 (CA)15 Allele 2 (CA)19 Si amplifica il DNA genomico da saggiare con i primers selezionati e si analizza su gel di agarosio 1 2 L’ analisi dei prodotti dell’ amplificazione mediante elettro-foresi su gel e colorazione con etidio bromuro permette di distinguere un allele dall’altro I MICROSATELLITI, possono essere usati per l’analisi di “linkage” con determinate malattie L’amplificazione di più loci “microsatellite” potrà dare inoltre un’indicazione utile alla GENOTIPIZZAZIONE!

Esempio di analisi di “linkage” di un polimorfismo dovuto a MICROSATELLITI, mediante analisi per PCR Prodotti della PCR MIV MII MI MIII MII X P MIII P MIV Legenda: primer per la PCR ripetizioni dei microsatelliti Allele dominante che causa la malattia P marcatori molecolari (MICROSATELLITI) MI-> MIV La malattia in questo caso risulta associata al marcatore MII

Esempio del “fingerprint del DNA” con una sonda “microsatellite”, mediante analisi per SOUTHERN BLOT per la GENOTIPIZZAZIONE Digerire il DNA genomico con un enzima di restrizione che NON TAGLIA all’interno del MICROSATELLITE Individuo A Individuo B Separare i campioni di DNA su gel e trasferirli su nitrocellulosa ed ibridare con una sonda corrispondente al MICROSATELLITE Locus 1 Individui A B C D Locus 2 Locus 3 Locus 4 …………… e altri loci addizionali

I MICROSATELLITI e la famiglia Romanov Il “fingerprint del DNA” con i MICROSATELLITI, ha dimostrato che i resti scheletrici (9 scheletri: zar, zarina, tre figlie, 3 servitori e un diplomatico) rinvenuti a Ekaterinburg (Siberia) appartenevano allo zar Nicola II ed alla sua famiglia, che furono uccisi nel 1918. Questa relazione è stata stabilita confrontando il DNA delle ossa dissotterrate con dei campioni ottenuti da parenti da parte della zarina ( il principe Filippo di Edimburgo) Un’altra importante osservazione è stata che mancavano nella fossa una figlia (Anastasia?) e l’unico figlio maschio dello zar (Alessandro), che poi furono trovati in seguito!

I MINISATELLITI ed il “ fingerprint del DNA” Anche i MINISATELLITI, come i microsatelliti, sono loci distinguibili per le dimensioni piuttosto che per sequenza; possono variare da 1 a 20 kb (20-100 bp ripetuti da 50 a 200 volte) Nel 1985 Alec Jeffreys dimostò che ogni locus minisatellite è altamente polimorfico ed i minisatelliti si trovano distribuiti in tutto il genoma. Molti loci minisatellite possono essere individuati con la stessa tecnica di PCR descritta per i microsatelliti, ma poiché alcune di queste sequenze si ritrovano SOLO in un PICCOLO NUMERO DI LOCI genomici possono essere individuati per Southern; le sonde che riconoscono i minisatelliti sono efficaci per ottenere "il fingerprint del DNA". per identificare i polimorfismi di lunghezza ai loci usando enzimi di restrizione e Southern blot si usano enzimi che non tagliano dentro il minisatellite ma ai lati. I frammenti sono poi separati su gel di agarosio,trasferiti ed ibridati con la sonda minisatellite. I minisatelliti forniscono un'immagine generale dell'intero genoma piuttosto che di un singolo locus La probabilità che due individui non imparentati abbiano un GENOTIPO IDENTICO a 10 loci contenenti lo stesso minisatellite ha una bassissima probabilità ( è sufficiente usare 2 MINISATELLITI non correlati e analizzare circa 24 loci genomici (24 bande di ibridazione) per definire con certezza se 2 campioni di DNA appartengano alla stessa persona oppure no. Sono loci polimorfici e sono l'ideale per la correlazione genetica tra due individui o tra un individuo ed il DNA ritrovato per esempio sulla scena di un crimine.

I MINISATELLITI e la pecora Dolly Una delle obiezioni al clonaggio di Dolly fu che l’ovocita da cui Dolly poteva essere stato fecondato da spermatozoi contaminanti 1 2 U C D 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 U= coltura cellulare preparata dalle cellule di mammella della pecora donatrice C= dalle cellule del sangue della pecora donatrice D= dalle cellule del sangue di Dolly Da 1 a 12= pecore di controllo Kb 12 10 8 6 4 L’analisi con i MINISATELLITI è servita per confermare che la pecora DOLLY è stata effettivamente clonata

Fusione e attivazione mediante una piccola scarica elettrica Clonazione: la pecora Dolly (Wilmut et al. 1997) Pecora donatrice Separazione delle cellule e induzione al dedifferenziamento tenendole in un mezzo privo di nutrimento Epitelio mammario Cellula uovo non fecondata Il nucleo viene eliminato pipetta Cellula mammaria Fusione e attivazione mediante una piccola scarica elettrica L’embrione viene coltivato in vitro Madre adottiva L’embrione viene impiantato nell’utero di una madre adottiva Da questo embrione si sviluppa un agnello del tutto simile alla pecora donatrice Dolly

Il primo caso risolto con la genetica forense 1985: MINISATELLITI, inizia l’era del DNA typing Il primo caso criminale risolto mediante DNA typing: il signor Colin Pitchfork 1983: Lynda Mann, 15 anni, viene violentata e uccisa nel Leichestershire (UK) 1986: Dawn Ashworth, 15 anni, viene violentata e uccisa nella stessa zona Il modus operandi nei due delitti era lo stesso ed il gruppo sanguigno (gruppo A), determinato dalle tracce di liquido seminale, era il medesimo. 1986: Richard Buckland, un ragazzo del posto, venne incriminato dei due delitti, ma l’analisi del DNA mediante fingerprinting con i minisatelli (da poco scoperti) rivelò che egli era innocente. Circa 5000 individui nel Leichestershire possedevano il gruppo sanguigno A. Si organizzò uno screening di massa ed in nessun caso il DNA fingerprinting dei 5000 individui corrispondeva a quello dell’assassino. 1987: Per un puro caso, si venne a sapere che una persona del posto, un certo Colin Pitchfork, aveva chiesto ad un amico ed ottenuto di partecipare allo screening in sua vece. Il signor Pitchfork venne invitato a donare il sangue ed il profilo del suo DNA risultò identico a quello del DNA raccolto sulla scena dei due delitti.

“DNA fingerprint” con i MINISATELLITI come prove legali Nel 1986, Richard Buckland fu assolto per lo stupro e l'omicidio di un adolescente vicino a Leicester, la città in cui profilo del DNA è stato scoperto( Alec Jeffreys). E’ stato il primo utilizzo del DNA fingerprinting in un'indagine penale. Nel 1987, nello stesso caso, Buckland, un panettiere britannico Colin Pitchfork è stato il primo criminale catturato e condannato con impronta digitale del DNA. Nel 1993 i tribunali degli USA hanno accettato per la prima volta l’analisi del DNA nei processi per omicidio e per violenza sessuale In Italia, solo nel 2009, è stata inserita la prova del DNA nella legge 85! Solo recentemente si è legiferato per la banca dati del DNA S1 =DNA da sospetto 1 S2 =DNA da sospetto 2 E(vs) =DNA da prove rac- colte sul luogo del crimine

Minisatelliti: esempio di «DNA fingerprinting»

VANTAGGI degli STR rispetto ai VNTR Tecnicamente gli STR, a confronto con altri marcatori, presentano il vantaggio di essere: Numerosi Equamente distribuiti in tutta la parte eucromatica del genoma Altamente polimorfici e quindi informativi Analizzabili facilmente tramite PCR Questa relativa facilità di studio ha portato ad un rapido incremento del numero degli STRs esaminati Catalogazione standard: - ad esempio D12S324, dove 12 è il cromosoma sul quale il marker è localizzato e 324 è un codice identificativo Bennett - Demystified...Microsatellites. J Clin Pathol:Mol Pathol2000,53:177-183)

I microsatelliti nella Genetica forense Si è reso necessario identificare un set unico (core) di microsatelliti, condiviso da tutta la comunità genetico-forense. CODIS (Combined DNA Index System) Programma dell’FBI in supporto alla giustizia attraverso l’utilizzazione di databases di profili genetici. Pannello di 13 microsatelliti «core» (in giallo) secondo il CODIS, USA I 13 microsatelliti furono scelti nel 1997 a partire da 17 loci candidati, in base alla loro variabilità e facilità di interpretazione dei risultati. I 13 loci sono tutti «tetranucleotide repeats». L’analisi dei 13 loci del CODIS porta a profili genetici la cui probabilità di random match media è minore di 1 su un milione di milioni (10-12) . In UK e alcuni altri stati Europei si utilizza un core di 10 STR, 8 dei quali in comune con il CODIS

Generare un profilo STR: 2. Amplificazione mediante PCR multiplex Amplificare tramite PCR contemporaneamente più microsatelliti (multiplex), utilizzando primers fiancheggianti ciascun locus Per ottenere buoni risultati i primers devono essere scelti con attenzione: Le temperature di annealing dei vari primers devono essere simili Devono essere valutate e minimizzate le possibili interazioni tra primers, anche appartenenti a coppie diverse (esempio complementarietà al 3’) - Con le nuove macchine i frammenti ampliificati sono marcati covalentemente con differenti fluorofori